Cochlea

adina 18 · Gast

Meine Frage:
hallöchen alle zusammen!
ich habe eine frage zum paper: integrity and Regeneration of Mechanotransduction machinery regulate aminoglycoside entry and sensory cell death

und zwar wurde dort Mutanten von mäusen gemacht. jetzt steht da einmal Cdh23v2J/+ und einmal Cdh23v2J/v2J
Wo liegt zwischen den beiden Mutatanten der unterschied?
ich weiß das diese Zelllinie eine Punktmutation trägt. aber mir ist dennoch der unterschied zwischen diesen beiden Mutanten nicht klar. Kann mir vllt jmd helfen?

Meine Ideen:
danke schon mal

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Hi,

das sind nicht verschiedene Mutanten sondern verschiedene Genotypen.
+ bezeichnet hierbei üblicherweise das Wildtypallel und V2J das mutierte.
Ein Tier mit +/+ ist homozygot für das Wildtypallel, ein Tier mit +/V2J ist hetereozygot und ein Tier mit V2J/V2J ist homozygot für das mutierte Allel.

Für die Mutation an sich schau hier: (Seite 3)

http://sro.sussex.ac.uk/15603/1/journal.pone.0019183.pdf

LG,

Firelion

adina18 · Gast

danke:)
dann hätte ich noch eine frage: es wird geschrieben, dass die Offenwahrscheinlichkeit vom MET-Kanal durch hypokalzämie verbessert wird und dadurch auch die Antibiotika-Aufnahme. Warum ist das so?
also ich weiß dass die Calciumionen an der Kanalaktivierung beteiligt sind. aber so wie es da steht würde es ja heißen, dass der Kanal aktiviert wird, wenn die Ca2+ in der Zelle gering ist, ist das so richtig? praktisch, dass wenn zu wenig Caclium in der Zelle enthalten ist, öffnet der Kanal, so das mehr Calcium in die Zelle gelangt und entsprechende Funktion ausüben kann?
was bedeutet denn spatio-temporal maturation of hair cells (steht gleich am anfang der Einleitung).
das Gegenteil ist dann hyperkalzämie, d.h. wenn calciumkonzentration in der zelle hoch ist, ist MET-Kanal geschlossen, sodass folglich auch weniger aminoglykoside aufgenommen werden können und damit die Hörzellen am leben bleiben.
ist das so richtig?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Hi,

Spatiotempeoral maturation = zeitlich räumliche Reifung/ Entwicklung.

In den Experimenten hier geht es darum, dass Ca2+ nötig ist, um die Tiplink Struktur aufrecht zu erhalten. MET Kanäle sind Kanäle, die auf den mechanischen Reize der Bewegung der Haarzellen reagieren. Wenn die Tiplinkstruktur defekt sindt, funktionieren diese Kanäle nicht mehr.

Hypokalzämie/ Hyperkalzämie bezieht sich hier auf die äußere Ca2+ Konzentration (Quellen) wird in dem Paper aber nicht weiter betrachtet. Es wird nur angeführt, um zu zeigen, dass die MET Kanäle wichtig sind.

Warum jetzt Hyperkalämie die Offenwahrscheinlichkeit heruntersetzt kann ich ohne weitere Recherche nicht sagen. Aber ich könnte mir vorstellen, dass das etwas mit der Änderung des Membranpotentials zu tun hat (das hängt ja auch vom Konzentrationsunterschied innen/außen ab) . Durch verschiedene Pumpen/Transporter kann auch die äußere Konzentration, die innere Ionenkonzentration beeinflussen. das ist aber fürs Verständnis dieses Papers nicht wichtig. Ansonsten versuch mal an die Paper die dafür zitiert werde zu kommen.

adina 18 · Gast

ich habe noch eine weitere frage. in abb. 4 sind unten Diagramme dargestellt. was genau sollen die bedeuten? also im test stehen sie zeigen den basal-apikalen Gradienten. aber was ich nicht verstehe, ist warum es mehrere rote und grüne balken pro Diagramm gibt und warum ist die fluoreszentintensität in mehrere Bereiche eingeteilt? verstehe diese Einteilung nicht....

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Die Diagramme zeigen die Verteilung der Floureszernzintensitäten an.
Die Einteilung ist nützlicher, da verschiedene Zellen einer Probe unterschiedlich viel Genatmicin aufgenommen haben. Dadurch wird der Unterschied zwischen den Bedingungen wahrscheinlich deutlicher als, wenn man nur die mittlere Floureszenzintensität darstellen würde.

adina 18 · Gast

und was hat es mit Abb. 1A auf sich? dient es nur zur übersicht um zu zeigen, dass die Cochlea in apikale, mittlere und basale windung geteilt wird? und warum wird für das 1- Experiment (S.4) nur die mittlere Windung verwendet? für die anderen Experimente hat man ja schon immer alle windungen betrachtet?

adina 18 · Gast

und warum misst man den zeitverlauf der AG-Aufnahme?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

1A) zeigt wo in der Cochlera Haarzellen sind.
Warum sie nur die mittlere Windung verwendfet haben weiß ich nicht. Vielleicht haben sie erst später angefangen sich für die anderen zu interessieren. Oder eshatte Zeit/Kostengründe. oder es waren noch Daten von einem anderen Projekt etc.Der Zeitverlauf liefert weitere Daten und zeigt hier, dass es zwische Wildtyp und Heterozygot kein Unterschied besteht. Für Kanäle, Pumpen etc ist es üblicher auch Zeitverläufe darzustellen.

adina 18 · Gast

ich hab dann noch ne frage zur 2. Abbildung. darin wird ja einfach nur gezeigt, dass im Wildtyp und in heterozgoten Mäusen GTTR schnell aufgenommen wird. in homozygoten Mäusen dagegen wird es gar nicht nachgewiesen. und die Abbildung 2D quantifiziert die Fluoreszenzintensität, richtig? was heißt jetzt aber t1/2?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Ja.

t 1/2 bezeichnet die Halbwertszeit ein wichtiger pharmokinetischer/ toxokinetischer Parameter. Die Halbwertszeit ist die Zeit, die benötigt wird um die Hälfte des vorhandenen Wirkstoffs abzubauen.

adina 18 · Gast

aber in 2D wird doch nix abgebaut. ich dachte es zeigt, dass viel GTTR aufgenommen wird durch Wildtyp und Heterozygoten. und dann wird irgendwann eine Sättigung reicht. kann man das so sagen? und im text steht z.b. für den Wildtyp eine Halbwertszeit von 8,7 min. aber da ist doch noch nicht die hläfte von gentamycin abgebaut? irgendwie versteh ich das nicht ganz...

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Normalerweise ist es so, dass je mehr Wirkstoff aufgenommen wurde desto mehr wird pro Zeit abgebaut (Ausnahme ASS und Ethanol).

Das Gentamicin ist ja zunächt im Merdium also außerhalb der Zellen. Wenn man einen Wirkstoff einmalig dazugibt wie hier gibt, steigt zunächst die Konzentration dieses in den Zellen/Geweben etc.. an, da pro Zeiteinheit viel mehr Wirkstoff aufgenommen als abgebaut wird (hier in den ersten Minuten). Dieser Anstieg wird mit der Zeit immer langsamer, da der Abbau in den Zelle/Geweben mit steigender Konzentration des Wirkstoffes in diesen zunimmt (hier im Bild ca. Minute 8 sichtbar) Irgendwann wird dann ein Plateau erreicht (hier ca. Minute 20) , wenn sich Aufnahme und Abbau die Waage halten. Wenn man dann noch länger beobachten würde, würde die Floureszenz weiter abnehmen, da dann der Abbau die Aufnehme überwiegen würde (zum Einen durch die Kinetik zum anderen ist irgendwann kein Wirkstoff mehr da der aufgenommen werden könnte).

Ich weiß das ist kompliziert. Schau dir vielleicht im Internet eine Einführung in die Pharmakokinetik an, wenn es dich interessiert.

adina 18 · Gast

abbildung 4 verstehe ich leider immer noch nicht richtig, also die Histogramme. könntest du mir das vllt einmal an einem der Diagramme erklären?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Laut Text haben sie die Floureszenz mit der Intensität zu der am stärksten gefärbten Zelle normalisiert (also [gemessene Intensität/höchste Intensität] * 100). Dann haben sie Bereiche (Bins) von je 10% gewählt (wobei 100% so hell wie hellste Zelle bedeutet) und gezählt wieviel Prozent der Haarzellen jeweils in disen Bereichen liegen. Das haben sie jeweils für die Bedingungen nur Antibiotikum und Antibiotikum + Chelator gemacht.
Die Balken zeigen hier bei an wieviele Zellen in dem jeweiligen Bin sind. Die Kurve verbindet die jeweiligen Balken miteinander. Die Fläche unter die der Kurve erfasst ale Zellen in der Probe.

Abbildung 4 H zeigt, dass bei Behandlung mit dem Antibiotikum fast alle Zellen im Bereich der geringsten Floureszenz liegen, während bei Behandlung mit dem Antibiotikum nach der Calciumchelation nur ca. 75% der Zellen im Bereich der geringsten Floureszenz und ca 25% im Bereich der zeit geringsten Floureszenz liegen. Insgesamt zeigt diese Abbildfungsreihe, dass die Floureszenz unabhängig von der Art der Behandlung von apikal nach basal zunimmt (mehr zellen in den Bins mit höherer Floureszenz).

adina 18 · Gast

kannst du mir noch dagen was der unterschied zwischen z.b. B und B´ist? und müssten die haarzellen in diesem bild nicht kaputt sein, da sie ja gentamycin aufgenommen haben, welches ja zum verlust der haarzellen führt?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

B zeigt den toten Kanal (Gentamicin) und den grünen Kanal (Myosin) übereinander gelagt.
B' zeigt nur den roten Kanal (Gentamicin).
Nein, da B und B' kein Gentamicinsignal zeigen und die Inkubationsdauer nicht ausreicht, um den toxischen Effekt zu zeigen. Hier ging es nur um die Aufnahme von Gentamicin in die Zelle.Der toxische Effekt wird in Abbildung 5 gezeigt.

adina 18 · Gast

hm das versteh ich nicht ganz. also das mit der inkubationsdauer schon, aber es gibt doch eine gentamycinsignal, sonst wäre doch die rote Fluoreszenz nicht da oder wie meinst du das?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Bei Abbildung 4 B und 4 B' ist keine rote Floureszenz zu sehen.
Das ganze schwache Rot bei 4B' ist Hintergrudfloureszenz.
Aber, da die Tiplinks hier auch in 4C, 4C' und 4 D, 4 D' intakt sind, ist das auschlaggebende die Inkubationsdauer.

adina 18 · Gast

ok, das versteh ich. jetzt sitze ich aber noch vor den Histogrammen und versuch die richtig zu kapieren. verstanden habe ich dass pro Fluoreszenzintensität die Haarzellen in Prozent angegeben sind. und z.b. bei 4H sind fast alle Haarzellen im ersten fluoreszenzbereich (bezogen auf BAPTA) und nur wenige im zweiten Fluoreszenzbereich, usw. aber ich versteh noch nicht was mir das sagen soll. du meintest ja das zeigt den basal-apikalen Gradienten. aber sieht doch nur dass die fluoreszenzintensität verteilter ist auf die verschiedenen Bereiche oder?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Diese Verteilung ist der basal-apikaler Gradient.
Apical wird kaum Gentamicin aufgenommen und basal wird viel aufgenommen.
Desweiteren zeigt, dass Calciumchelation die Aufnahme von Gentamicin reduziert.

adina 18 · Gast

und warum wird apikal nur wenig gentamycin aufgenommen, basal dagegen aber viel? ändert sich da die anzahl der haarzellen oder woran liegt das?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Die Erklärung der Autoren steht in der Diskussion:

"One proposed explanation for the basal-apical gradient of AG toxicity is that basal hair cells contain larger MET currents facilitating AG entry" usw.

adina 18 · Gast

ok soweit hab ich das einigermaßen verstanden. jetzt bin ich bei Abbildung 7. Bei A bis C ist ja wieder die Fluoreszenzintensität dargestellt, die von apikal nach basal wieder zunimmt bei Zugabe von GTTR 6 stunden nach der BAPTA-Behandlung. Gleiches ist auch in D -F, nur das das hier für 24 stunden gemeint ist. aber auch hier scheint es diesen Gradienten zu geben, wobei ich finde dass es von der mittleren zurbasalen windung kaum eine Steigerung der Intensität gibt, oder?
und jetzt zu D´,E´und F´. ist es so dass die Diagramme von oben einfach zusamengefasst wurden? soll das jetzt einfach zeigen, dass die Fluoreszenz von GTTR nach einer bestimmten Zeit nach BAPTA-Behandlung wieder zunimmt? Das sich die Zellen praktisch regenerieren und wieder in der lage sind über den Kanal GTTR aufzunehmen? woher kommen denn die 10 min post BAPTA, also die blauen Kurven? und bei diesen diagramen ist doch aber nicht mehr wirklich ein Gradient zu erkennen oder?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Man sieht in allen drei Serien einen Gradienten. Jetzzt nicht drastisch aber er ist erkennbar.
Ja D', E' und F' vergleichen die Ergebnosse nach Behandlung mit Gentamicin zu drei verschiedenen Zeitpunkten post BAPTA. Die 10 Minuten wurden im Text nicht erwähnt scheinen aber eine eigener Versuch gewesen zu sein.
Du erkennst den Gradientzen daran, dass es von apikal zu basal zur Rechtsverschiebung (Richtung höhere Floureszenzintensität) der Kurven kommt.

Ansonsten , stimmt das.

adina 18 · Gast

ah ok. und die Prozentangaben die da gemacht wurden, sind die wichtig? ich versteh nämlich nicht ganz was sie bedeuten.

adina 18 · Gast

ich versuche mir grad zu verstehen warum die Experimente so gemacht wurden, wie man sie gemacht hat. Und zwar:
Abbildung 1 zeigt die Wirkung von Gentamicin auf Haarzellen.
Abbildung 2 zeigt nur wie Gentamicin durch die 3 Genotyen aufgenommen wird (hat noch nichts mit Toxizität zu tun, richtig?) und hier ist dann vermutlich auch die inkubationsdauer so kurz gewählt, dass nichts zerstört werden kann? man will also praktisch nur sehen ob Gentamcin aufgenommen wird?
Abb. 3 zeigt toxischen Effekt von Gentamicin auf die haarzellen der verschiedenen Genotypen. man will also sehen welche Wirkung gentamicin in den Genotypen hat? aber ist das nicht eigentlich überflüssig, weil ja schon in Abb.1 die Wirkung getestet wurde?
Abb.4 da will man wissen ob ein gezielte Zerstörung der tip-links (nicht durch Mutation verursacht) die AG-Aufnahme beeinflusst?
Abb.5 damit untersucht man, ob chelation schutz gegen Toxizität von gentamicin liefert?
Abb.6 +7 Haarzellen können regenerieren und so auch auch Fähigkeit zur AG-Aufnahme wiedererlangen
Abb. 8 zeigt das regenerierte HAarzellen auch wieder durch Gentamicin zerstört werden können

ist das so richtig verstanden?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Die Prozentangaben zeigen wie viele der Zellen in welchem Bin liegen.

Abbildung 3 zeigt sowohl den Einfluss der Genotypen auf die Gentamicinaufnahme als auch den Einfluss der Genotypen auf die Toxizität.

Ja. Abbildung 4 zeigt die Rolle des Calciums und der Tiplinks auf die AG Aufnahme.

adina 18 · Gast

mit Calcium meinst du, dass wenn der Chelator eingesetzt wird, dieser Calcium bindet, wodurch dieses nicht mehr genutzt werden kann für Cadherin23? oder was sieht man in bezug auf Calcium in Abbildung 4?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Genau.

adina 18 · Gast

kurz nochmal wegen den Prozentangaben: du meinstest ja ein bin ist ein balken. aber in abb 4 D´-F´sind ja keine Balken. auf welchen Bereich bezieht sich dann die zahl der zellen? tut mir leid dass ich so viele fragen stelle. :/

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Bin ist bei Histogrammen eine Bezeichnung für einen Bereich. Tut mir Leid, wenn das verwirrend war.

Es bezoeht sich immer um einen Bereich von 10%:

0 - 9; 10 - 19; etc.

Dabei ist es immer die Floureszenzintensität der Zelle im Vergleich zu der floureszenzntensivsten Zelle.

adina 18 · Gast

hm irgendwie versteh ich das leider nicht. vllt ist es am Beispiel besser? wenn wir z.B. beim Apex gucken, was bedeutet die 90,8% dann?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Oh du meinst bei D' - F_.

Laut Text (Bildunterschrift): "Percentages indicate fluorescence intensities from the BAPTA-treated group in comparison to those from the same cochlear turn from untreated, time-matched controls.".

Also bedeutet 90,8, dass 10 Minuten nach dem Entfernen von BAPTA 90,8 der Zellen im Vergleich zur Kontrolle wierder Gentamicin aufnehmen können.

adina 18 · Gast

ok das versteh ich smile

jetzt noch zu abb. 6. Also da geht es ja darum, dass untersucht werden soll, ob sich die tip links nach Behandlung mit Chelator wieder regenerieren und GTTR wieder aufnehmen können. Nur die Bilder verwirren mich ein bisschen. warum sind dazwischen immer noch bilder nur mit gentamicin? wie muss ich das verstehen?

adina 18 · Gast

wie muss ich mir denn die 2-photonen-mikroskopie vorstellen? wurde die ganzen Abbildungen mit diesem mikrokop aufgenommen? und dann noch eins es wurden ja teilweise Gentamicin und myosin7a markiert mit entsprechenden Antikörpern. zuerst wird das gentamicin zugegeben und dann der Antikörper oder? achso und die Cochlea wird ja immer isoliert und dann kultiviert. warum wird es kultiviert?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Hi,

das sind die time matched Kontrollen.
Die Kultur ermöglicht die Folgen der Gentamicinbehandlung zu sehen. Außerdem leben isolierte Organe/Zellen ohne Kultur nicht lange bzw funktionieren nicht mehr genug,.

Zur Reihenfolge: s. Material und Methoden.

ur Mikrroskopie: Schau mal hier https://de.wikipedia.org/wiki/Multiphotonenmikroskop

adina 18 · Gast

was bedeutet denn time-matched? also worauf ist das bezogen?

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Eigentlich sollten die Zellen in beiden Gruppen identisch behandelt worden sein mit dem einzigen Unterschied, dass eine Gruppe eine Zeit mit BAPTA behandelt wurde und die andere nicht.
Also als die einen Zellen die Lösung mit BAPTA bekommen haben, haben die anderen Zellen die gleiche Lösung ohne BAPTA bekommen, beide wurden 15 Minuten unter Rühren inkubiert und beide hasben dann BAPTA freies Medium bekommen.

Das time matched bezieht sich dann darauf, dass aus beiden Gruppen dann einige Zellen nach 6 Stunden in dem neuen BAPTA freiem Medium mit Gentamicin behandelt wurden, aus beiden Gruppen ein paar Zellen nach 24 Stunden in dem neuen Medium und aus beiden Gruppen manche Zellen nach 48 Stunden in dem neuen Medium.
Dadurch besteht der Unterschied nur in der frage, ob die Tiplinks zerstört waren oder nicjht. Ohne dieses Vorgehen time matched controls könnte ein beobachteter bzw nicht beobachter Effekt auch an der Zeit in Kultur, dem unterschiedlichen Stress (Rühren, Mediumswechsel), dem unterschiedlichen Medium, der unterschiedlichen Zeiti m Medium liegen.

adina 18 · Gast

ah ok. und eins noch zum ersten Experiment. da wird ja die Kultur nach gentamicin-behandlung 48 stunden in ag-freiem medium gelassen. im text steht um die Degeneration der haarzellen abzuschließen. hab ich das so richtig verstanden? damit einfach genug zeit ist damit die haarzellen zerstört werden können? aber warum nimmt man dazu ag-freies medium?