Unterschiede zw. transgenen Organismen und Knock-Out

Rotfuchs · Anmeldungsdatum: 06.02.2017 Beiträge: 17

Hey!

Nach einem langen Hin und Her und nachdem ich den ganzen Post schon zigmal gelöscht hab, würd ich jetzt ganz einfach nur gern erfahren, ob ein Knock-Out eine Möglichkeit zur Herstellung transgener Organismen ist oder ob das tatsächlich 2 verschiedene Sachen sind (mit verschiedenen Abläufen, ...)?

Bzw stellt man sie auf die gleiche Weise her? Also dass man Stammzellen entnimmt, diese dann verändert und dann in einen Embryo einsetzt?

Mit freundlichen Grüßen
Rotfuchs

Pimpernelle · Gast

Hallöhchen, sie sind total unterschiedlich: "transgene" sind Organismen mit einer ungerichteren Insertion eines fremden DNA stückes (Transgen) im Genom. Sie entstehen durch Mikroinjektion eines linearen DNA Fragmentes in den Vorkern befruchteter Eizellen und der Aufnahme ins Genom durch zelleigene Reparaturmechanismen. Meist inserieren viele Kopien des Fragmentes "head to tail" an einem Ort.
"Know outs" entstehen zum einen auf dem von Dir beschriebenen Weg über die Einführung der Mutation und Selektion der Mutante mittles molekularbiologischer Methoden in Embryonalen Stammzellen. Diese werden dann in das Embryonalstadium der Blastocyste, genauer gesagt in den flüssigkeitsgefüllten Hohlraum das Blastocoel dieses Embryos mikroinjiziert. Die ES Zellen mischen sich mit den Zellen der inneren Zellmasse (aus solchen Zellen wurden ES Zellen als Zelllinie früher mal etabliert) dieses Embryos und es werden nach Übertragung in ein scheinschwangeres Muttertier sogenannte Chimäre Organismen geboren, mithilfe derer in einem weiteren Zuchtschritt dann eine Keimbahntransmission der K.O. Mutation erzielt werden soll.
Zum anderen werden Knock outs seit Beginn der Crispr Cas Technik auch wie die Transgenen durch Vorkerninjektion hergestellt.
Hierbei injiziert man die Komponenten des CRIspr/Cas systems als RNA oder/und Protein. Cas9 ist eine Nuklease, die durch Kombination mit einem oder zwei sequenzspezifischen RNA Molekülen die DNA an einer bestimmten Stelle schneidet. Dies aktiviert zelleigene Reparaturprozesse, die unpräzise arbeiten, sodass an den Bruchstellen Insertionen oder Deletionen in der Nukleotidseuquenz auftreten, die zu sog. Leserastermutationen und damit meist zu einer Inaktivierung der Genfunktion also zum KNOCK OUT führen. Bei dieser Technik enstehen meist homocygote Mutanten in einem Schritt, da die Aktivität des Enzyms sehr stark ist. Dies spart 2 Generationen Zucht des Organismus, was beispielsweise bei Mäusen 6 Monate ausmacht.