Gelelektrophorese und PCR

Joline · Anmeldungsdatum: 24.02.2008 Beiträge: 3

hallo.
ich hab nur einige allgemeine Fragen.
1. es ist doch so, dass die DNA jedes Menschen zu 99,9 % gleich ist, und nur die Anzahl der Motive sich unterscheidet, oder?
2. bei Chorea Huntington ist es ja auch so.. aber meine Frage ist, wenn ich die Anzahl der CAG-Tripletts dann duch die Gelelektrophorese bestimmen möche, wird doch eine Vorlage benötigt, um ablesen zu können wie viele Wiederholungen jetzt auftreten. mir ist klar, das die kurzen Fragmente schnell wandern, die langen,langsam.
Aber was dient mir als vorlage?

revilo · Anmeldungsdatum: 13.12.2007 Beiträge: 79

Molekulare Diagnostik
Die molekulargenetische Diagnostik der Chorea Huntington erfolgt über die Längenbestimmung von spezifisch amplifizierten PCR-Produkten und der sich daraus ableitenden Anzahl an CAG-Triplett-Wiederholungen. Die genaue Längenbestimmung der aus zwei unabhängigen PCR-Reaktionen resultierenden allelspezifischen Fragmente erfolgt mittels Polyacrylamidgelektrophorese. Nicht verlängerte und pathologisch verlängerte Nukleotidtripletts werden durch mehrere PCR-Reaktionen mit unterschiedlichen Primerpaaren nachgewiesen.

Das habe ich gefunden ... also die Diagnose erfolgt durch Amplifikation des HD-Gens mittels PCR, je nachdem wieviele CAG-Wiederholungen es gibt, wird ein unterschiedlich langes Fragment amplifiziert ... du hast Recht, ein kurzes Fragment läuft kürzer, ein längeres Fragment läuft langsamer. Als Vergleich könntest du ein Gemisch an DNA-Fragmenten auftragen, deren Länge zu kennst ... die Marker gibt es zu kaufen, die DNA wird künstlich hergestellt, sodass du die Länge genau definieren kannst ... oder du trägst als Vergleich die DNA eines gesunden Menschen auf, der nicht an HD erkrankt ist, das entsprechende Fragment wäre ja kürzer. Du kannst auch die PCR-Fragmente sequenzieren und dann kennst du sogar die genaue Zahl an CAG-Tripletts.

Joline · Anmeldungsdatum: 24.02.2008 Beiträge: 3

ja gut das habe ich verstanden. danke:)

aber hast du vielleicht noch eine gute Seite zur Gelelektrophorese?
würde dieses Verfahren noch lieber besser verstehen.

Karon · Organisator Anmeldungsdatum: 06.11.2004 Beiträge: 2344 Wohnort: Hessen

Hallo und herzlich willkommen im Forum, Joline! Wink

Hier ist eine ganz kurze & sehr einfach gehaltene Seite zur Gelelektrophorese:
FZD

Und hier findest du eine ganze Lerneinheit über verschiedenste Elektrophorese-Arten:
chemgapedia

Joline · Anmeldungsdatum: 24.02.2008 Beiträge: 3

danke,..

aber ich habe noch eine weitere Frage.
Wenn ich die DNA durch Restriktionsenzyme in Fragmente zerschnitten hab, was bringt es mir, sie dann der Länge nach mit Hilfe der Gelelektophorese zu sortieren?
Zudem habe ich noch eine weitere Frage.
Das Ziel besteh darin, ein bestimmtes Gen zu finden, wie kann dann die Gensonde komplimänter zu einem Abschnitt sein?oder werden einfach ganz viele Gensonden eingesetzt, die dann ja irgendwann man passen müssen?

hoffe mir kann jemand helfen Hilfe

revilo · Anmeldungsdatum: 13.12.2007 Beiträge: 79

Nehmen wir an du nutzt das Restriktionsenzym EcoRI, dieses schneidet wie folgt:
G^AATTC
CTTAA^G
Nehmen wir weiter an du hast zwei PCR-Fragmente, die du miteinander vergleichst:

Das eines gesunden Menschen:

AATTGAATTCGG
TTAACTTAAGCC

Das eines Menschen mit einer Erbkrankheit (hier ist eine Base mutiert)

AATTGTATTCGG
TTAACATAAGCC

Wie du unschwer erkennen kannst werden beide Fragmente durch EcoRI unterschiedlich geschnitten:

Das des gesunden Menschen

AATTG^AATTCGG
TTAACTTAA^GCC

Das des erbkranken Menschen wird nicht geschnitten, weil eine Base der Erkennungssequenz mutiert ist.

Wenn du nun beide Restriltionsansätze auf einem Gel aufträgst, bekommst du beim gesunden Menschen zwei Banden, bei dem erbkranken Menschen nur eine Bande !!!

Die zweite Frage bezieht sich vermutlich darauf, wie eine Sonde herstellen, wenn man die Sequenz angeblich nicht kennt ?
Ich würde sagen, da gibt es zwei Ansätze, entweder du kennst die Sequenz und nutzt die Sonde dafür, festzustellen wie oft diese Sequenz im Genom vorkommt (im Falle von Genen, die in einer Vielzahl von Kopien vorkommen) oder du findest mit der Sonde die (in einem diploiden Organismus) vorkommende zweite Sequenz.
Dann gibts noch die Möglichkeit, das du das Gen einer verwandten Art kennt, z.B. du kennst das Gen im Menschen. Mit einer Sonde basierend auf der Sequenz des Menschen kannst du das entsprechende Gen z.B. im Genom von Schimpansen finden. Warum ? Die beiden Genome sind sich so ähnlich, dass die Sonde zwar nicht vollständig überlappt, wohl aber ausreichend, um das Gen im Schimpansen-Genom zu finden. Es gibt eine REihe von Genen, die nicht nur beim Menschen und dem Schimpnasen z.B. sehr ähnlich sind.