Genetischer Fingerabdruck - Rolle der Restriktionsenzyme

darkor · Anmeldungsdatum: 14.04.2008 Beiträge: 2

Hallo erstmal smile

also ich bin gerade beim Lernen ziemlich mit der Rolle der PCR und des Restriktionsenzyme durcheinander gekommen.

Zuerst war es eigentlich klar: Die Restriktionsenzyme schneiden bei jedem Menschen an unterschiedlichen Stellen auf den Introns und so entstehen unterschiedlich lange Fragmente, die sich dann beim Genetischen Fingerabdruck verwenden lassen.
ABER nach dem Lesen weiterer Texte wirkt es für mich jetzt so, als ob die PCR genau das gleiche Ergebnisse hat, weil da entstehen ja auch Fragmente bestimmter Längen.

Jetzt frage ich mich also

1) Was ist genau der Unterschied zwischen dem Einsatz von PCR und RFLP, ausser das bei der PCR halt die DNA vervielfältigt wird und bei RFLP nicht?

und

2) Wieso werden beide Methoden beim Genetischen Fingerabdruck zusammen eingesetzt? Theoretisch müsste doch eine alleine ausreichen. böse

Danke schonmal für eure Hilfe smile

PaGe · Moderator Anmeldungsdatum: 19.03.2007 Beiträge: 3549 Wohnort: Hannover

RFLP wird angewendet, wenn ausreichend genetisches Material vorhanden ist.
Die PCR braucht man, wenn nicht ausreichend Material vorhanden ist und das Schneiden der DNA dadurch zu keinem detektierbaren Bandenmuster führen würde.

Es werden nie ( grübelnd

) beide Methoden kombiniert. Vaterschaftstest wird mittels RFLP gemacht; Kriminalistik idR mit PCR.

DrunkenDevil · Anmeldungsdatum: 14.04.2008 Beiträge: 26 Wohnort: Köln

Hallo Dakor,
hier liegt ein grundsätzliches Verständnisproblem vor:
PCR ist erstmal mehr oder weniger die Grundlage für jedes Arbeiten mit DNA-Funden.
Bei der PCR werden einfach nur die Fundstücke vervielfältigt(Denaturierung, Primerhybridisierung, Elongation durch Taq oder ähnlicher Polymerase, Wiederholung).
Beim genetischen Fingerabdruck hast du jetzt 2 unterschiedliche Möglichkeiten:
Entweder du behandelst die Fund-DNA vor der PCR mit einem oder meheren Restriktionsenzymen, führst dann die PCR aus und jagst das ganze dann durch eine Gelelektrophorese, oder du benutzt RFLP. Bei der ersten Methode vergleichst du nun die längen der einzelnen zur Anode gewanderten Banden(die die weiter "vorne" sind, sind kürzer, die hinten sind länger) mit z.B. denen anderer Tatverdächtiger und denen des Opfers.
Beim genetischen Fingerabdruck macht wenn du RFLP benutzt eigentlich nur die T-RFLP-Methode Sinn(Terminalerestriktionsfragmentlängenpolymorphismus - hui ich habs geschafft ganz auszuschreiben).
Hierbei werden die Proben(Täter, Opfer, etc.) in vier Proben aufgeteilt und es wird eine nahezu normale PCR durchgeführt. Einziger Unterschied: In Probe eins wird neben den Primer, der Polymerase und den Nukleotiden, ein sogenantes "Abbruchsnukleotid" gemischt, auch DXTP genannt, z.B. das Abbruchnukleotid für Alanin, DATP.) In die anderen 3 Proben kommen entweder DTTP, DGTP oder DCTP.
Diese Abbruchsnukleotide sorgen dafür, dass es an beim Einbau zum Abbruch der Polymerase kommt - also zufällig, verschieden große Fragmente entstehen.
Im letzten Schritt führt man nun mit allen 4 Proben eine Gelelektrophorese aus und kann somit die genaue Abfolge der Basen feststellen(das Fragment das am kürzesten ist, also 1 Base lang, kommt zuerst, dannach die zweite Base etc.). Fertig!
Heutzutage benutzt man jedoch nicht mehr vier Proben, sondern eine Mischung in denen die Basen mit Flurezzensfarbstoffen makiert sind und alles komplett automatisch über den Pc läuft!
RFLP funktioniert übrigens nur bis zu einer gewissen Nukleotidmenge(frag mich nicht wieviel, 10000?) sicher, dannach müssen anderen Methoden herhalten!
Habe gerade noch eine schöne Animation zu RFLP allgemein gefunden - vielleicht hilft das ja auch den weiteren Verständnis!
http://www.lukashensel.de/biomain.php?biopage=abbruchd
Ich hoffe ich konnte dir helfen und ich habe trotz zwei Bier intus, nicht zuviel Mist geschrieben Augenzwinkern

Grüße!!!!

PaGe · Moderator Anmeldungsdatum: 19.03.2007 Beiträge: 3549 Wohnort: Hannover

@DrunkenDevil:
einige deiner Ausführungen zweifel ich an, bin aber nicht ganz in der Materie. Beim genetischen Fingerabdruck wird aber definitiv keine Kettenabbruchsynthese durchgeführt. Beim genetischen Fingerabdruck wird der genetische Code nicht entschlüsselt, sondern "nur" auf bestimmte Merkmale untersucht. Dies sind zum einen Mutationen, die Restriktionsstellen schaffen bzw. "löschen" und zum anderen die Anzahl gewisser Motive, die sich bei Menschen unterschiedlich häufig wiederholen und dadurch dann unterschiedlich lange Fragmente zwischen zwei Schnittstellen ergeben.

Wie die PCR genau eingesetzt wird, weiß ich nicht, jedoch würde man durch die PCR ja schon Fragmente erhalten. Kann aber durchaus sein, dass man das genetische Material aufgrund des Handlings zuvor doch erst schneidet. Halte es aber für unwahrscheinlich.

DerOssi · Anmeldungsdatum: 18.01.2008 Beiträge: 36

Da stimm ich zu. Ne Sequenzierung, und das klang ja nach der Sanger- Seq. kommt definitiv nicht vor.

DrunkenDevil · Anmeldungsdatum: 14.04.2008 Beiträge: 26 Wohnort: Köln

Beim Genetichen Fingerabdruck wird, soweit ich das weiß, mitlerweile wirklich kein RFLP eingesetzt - aber es kam ja die Frage dannach und es würd ja nur, wegen zu hohen Aufwand nicht eingesetzt.
Wie du PaGa ja bereits gesagt hat, benutzt man PCR i.d.R. vorallem für die Kriminalistik(genetischer Finabdruck) und RFLP für Vaterschafttests.
Die Fragmente bei der PCR müssen vorher geschnitten werden, da bei einer normalen PCR mit Taq-Polyermase nur ca. 3 kbp fehlerfrei funktionieren.
Heitzutage mischt man soweit ich weiß mehere Polymerase wodurch man dann bis 40 kbp Funde benutzten kann - immer noch kürzer als ein normales eukaryotisches Genom(3 millarden Basenpaare).

darkor · Anmeldungsdatum: 14.04.2008 Beiträge: 2

Erstmal danke für eure Hilfe, das hat mir schonmal echt weitergeholfen Smile

Eine Frage noch an Page:

Diese wiederholenden Motive von denen du sprichst, sind das die so genannten "variable numbers of tandem repeats"?

PaGe · Moderator Anmeldungsdatum: 19.03.2007 Beiträge: 3549 Wohnort: Hannover

DerOssi · Anmeldungsdatum: 18.01.2008 Beiträge: 36

Bert · Anmeldungsdatum: 26.09.2007 Beiträge: 82 Wohnort: Niedersachsen

DrunkenDevil · Anmeldungsdatum: 14.04.2008 Beiträge: 26 Wohnort: Köln

Also: Dass ich mit PCR bis auf Schulversuche nie groß gearbeitet habe, stimmt natürlich(bin wie gesagt gerade mein Abi am machen).
Das ihr Grundsätzlich recht habt, stimmt wohl sehr warscheinlich.
Aber einige Punkte, stimmen auch wieder nicht ganz bzw. haben bei nach meiner Meinung bei mir gestimmt...

Bert · Anmeldungsdatum: 26.09.2007 Beiträge: 82 Wohnort: Niedersachsen

Frage: Wird die Template-DNA vor einer PCR mit REN geschnitten?
Antwort: Es kommt auf die Aufgabe an, die man mit Hilfe der PCR lösen will. Grundsätzlich ist jedoch wichtig die Antwort auf ganz andere Fragen, und zwar:
Warum sollte man die Template-DNA vor einer PCR mit REN schneiden?
Welchen Einfluß hat ein solcher Schnitt auf die Ergebnisse der durchgeführten Versuche?

Das amplifizierte Fragment wird durch die gewählten Primer definiert und je nach Polymerase und Versuchsbedingungen kann man schon Fragmente bis zu 20 kBp amplifizieren (selten länger). Diese Länge kriege ich aus genomischer DNA, die ungeschnitten ist.

Was also bewirkt der Schnitt? Nun, je nach Aufgabe und DNA-Material, kann die vorherige Restriktion bewirken, daß ich überhaupt keine Amplifikate erziele! unglücklich

Warum? Wenn der Schnitt zwischen den Primer-annealing-sequenzen erfolgt, hört die Polymerase am Ende der Template auf zu synthetisieren, nämlich genau an der Schnittstelle!

========pf=======st===========pr=========

= dsDNA
pf Sequenz für Primer forward
pr Sequenz für Primer reverse
st REN-Schnittstelle

Hier wäre also ein vorheriger Schnitt verheerend. Nach dem Schnitt mit diesem REN erhalte ich zwei Fragmente (zwei DNA-Templates!):

========pf=======st
st===========pr=========

Keines dieser Fragmente kann mit dem Primerpaar pf/pr amplifiziert werden!

Natürlich gibt es auch Aufgaben, wo ein vorheriger Schnitt bessere Ergebnisse bewirken kann, aber das sind wirklich spezifische Aufgaben, die den Rahmen dieser Diskussion sprengen würden.

chefin · Organisator Anmeldungsdatum: 28.04.2004 Beiträge: 1549 Wohnort: Oberhausen

@Bert. in etlichen Schulbüchern steht,dass die DNA erst geschnitten wird, bzw. dass sie geschnitten wird, der Zeitpunkt wird dann offen gelassen. Dass die Praxis anders aussieht....Die Schulbücher sind 1. nicht fehlerfrei, 2. meist nicht auf dem neuesten Stand und die Lehrer verlangen das, was in den Büchern steht, weil auch sie wissen es nicht anders.

DrunkenDevil · Anmeldungsdatum: 14.04.2008 Beiträge: 26 Wohnort: Köln

Gut, wenn du damit arbeitest, dann wirst du's ja mehr als gneu wissen - und deine erklärung klingt auch sehr logisch!
Kann Chefin nur vollends zustimmen - es wird einen halt gerne was als ultimativ richtig verkauft, was in der Praxis anders aussieht.
Aber du sagst ja selber: Du hättest die Fragmente meistens nicht geschnitten => zumindest in Einzelfällen wird es gemacht!
Naja, ich denke das Thema ist geklärt, oder?
Beste Grüße!