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Studium: Kleine RNAs und RNA Interferenz
 
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Firelion



Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 08. Dez 2011 17:42    Titel: Studium: Kleine RNAs und RNA Interferenz Antworten mit Zitat

Hi,

wir haben heute von einer nicht weiter erläuterten Art der kleinen RNAs namens RASIrna gehört. Die Funktion sei es wohl an DNA zu binden und durch Deactylierung und Methylierung letzendlich zur Bildung von Hetereochromatin und damit zur Inaktivierung dieses Genomabschnittes (vermutlich hauptsächlich Repeats ?) kommt.

Von siRNAs weiß ich, dass aus dsRNsa mittels Dicer doppelsträngige, kleine RNA Abdschnitte gemacht werden die dann in einem RISC an mRNA binden und zum Abbau dieser führen. Wenn ich es jetzt richtig verstanden habe sind rasiRNAs eine Abart der siRNA die halt an DNA statt an mRNA bindet. Ist das soweit korrekt ?


Beim Versuch eine Erklärung zu finden bin ich auf diese Quelle gestoßen :
http://www.biolsci.org/v05p0097.htm
Hier ist von Argonautenbproteinen die Rede, die die ds RNa zu ssRNA machen durch Entwinden. Sind das Helikasen?

Weiß man wieso die mRNA abgebaut wird, wenn man eine siRNA anbaut ?


Danke und LG Firelion

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It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 09. Dez 2011 19:24    Titel: Antworten mit Zitat

Die Argonauten-Proteine sind u.a. die RNAsen des RISC-Komplexes, zumindest ist die PIWI-Domäne der RNAse H strukturell sehr ähnlich und sie können auch nukeleatische Aktivität entfalten.
Sie befinden sich meist cytosolisch. Dort können sie auch mit den Processing-Bodies (P-bodies) assoziiert sein. Dabei übernehmen sie aber nicht nur Aufgaben bei der nukleatischen Degradation, sondern können auch an der Rekrutierung von mRNAs in die P-bodies beteiligt sein und diese dort "festhalten". Ob degradiert wird oder eine Translationsregulation in hemmenden Sinne stattfindet, bei der die mRNAs durchaus auch wieder der Translationsmaschinerie zugeführt werden können, hängt bei miRNAs davon ab, wie stark die miRNA-Sequenz zu der mRNA-Sequenz komplementär ist. Bei vollständiger Komplementarität wird über RISC degradiert.

Die Argonauten-Proteine, die mit den rasiRNAs assoziiert sind, gehören zu einem anderen Subtypen der Argonautenproteine, der im Zellkern vorkommt. Auch bewirken rasiRNAs kein posttranskriptionelles silencing, sondern wirken auf transkriptioneller Ebene. Dennoch interagieren sie mit z.B. der antisense-RNA von Retrotransposons, und zwar noch am Ort der Transkription. Soviel ich weiss, ist der weitere Mechanismus noch unklar. Das ist ja auch eine wahrhaft neue Entdeckung. Auf jeden Fall entfalten sie ihre Wirkung nukleär und Dicer-unabhängig.
Die Veränderungen der Chromatinstruktur wird dabei von dem an die rasiRNAs gebundenen Argonautenprotein AGO4 vermittelt, welches ein Argonautenprotein ohne Nukleasefunktion ist. Es kommt cytosolisch und nukleär vor. Cytosolisch ist es in die miRNA-Antwort eingebunden, also dem posttranskriptionellen silencing.
Nukleär kann es das Methylierungsmuster beeinflussen. Über eine RNA-Helikase-Funktion weiss ich nichts, habe aber den von dir geposteten Artikel noch nicht gelesen.

siRNAs sind soviel ich weiss im Menschen nicht nachgewiesen worden, doch in Pflanzen sind sie Bestandteil des Immunsystems (soweit man bei Pflanzen von Immun"System" reden kann, aber eine Immun"Abwehr" gibt es da ja auf jeden Fall). Sie sollen also fremdes genetisches Material erkennen und der Degradation zuführen.

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Firelion



Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 10. Dez 2011 00:58    Titel: Antworten mit Zitat

Danke smile

Ein sehr interessantes Thema, das leider in vielen Büchern nicht oder nur knapp erwähnt wird und zwar häufig in Vorlesungen/Vorträgen erwähnt aber selten errörter wird.


Die miRNA dienen schätze ich mal auch unserem Schutz vor Viren etc. Wobei dann die Frage ist woher die Pflanze oder wir die vollsträndig komplenmentären Sequenzen für miRNA oder siRNA nehmen.

Das erinnert mich entfernt an die B/T- Zellrezeptoren. Ich stelle mir das jetzt so vor, dass die Pflsnze dann ja auf Verdacht durch ,, genetisches Lotto" die passenden kleinen RNAs bauen muss und gleichzeitig irgendwie screenen, dass sie nicht unkontrolliert ihre eigenen Transkripte zerhackstückelt. So ähnlich wie Bakterien durch Methylierung ihre eigene DNA vor den ER schützen. Wenn da was kaputt gehen würde in dem meiner Einschätzung nach hochregulierten System- dann wäre es ja theoretisch mglich, dass Pflanzen an einer "Autoimmunerkrankung" leiden. Oder ziehe ich gerade falsche Schlüsse ?


RNA Interferenz eignet sich für die Herstellung von Kockout Sytemen, oder ? Wenn ich in irgendeinem meiner Modellorgnismen wie Drosophila, c. elegang, Maus,Ratte, Zebrafisch und so on durch gezieltes Gen Silencing meine RNA x auschalte, weil ich denke sie versucht eine Krankheit beziehungsweise ihrer Funktion ist essentiell für die Gesundheit, müsste ich den Effekt so studieren können ohne die Gensequenz zu verändern . Eine Frage: wäre das dann streng genommen ein GVO ? Bei dem Ansatz lässt man ja das Genom in Ruhe ?

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Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 10. Dez 2011 09:02    Titel: Antworten mit Zitat

Firelion hat Folgendes geschrieben:

Die miRNA dienen schätze ich mal auch unserem Schutz vor Viren etc.


miRNAS dienen v.a. der endogenen Expressionsregulation, indem sie mit zellulären Genen interferieren.
Wenn sie perfekt "passen" führt das zur Degradation, wenn nicht, dann kommen die mRNAs erstmal in die P-bodies und können degradiert oder wieder den Polysomen zugeführt werden.



Firelion hat Folgendes geschrieben:
Wobei dann die Frage ist woher die Pflanze oder wir die vollsträndig komplenmentären Sequenzen für miRNA oder siRNA nehmen.


Na ja, ich denke, das könnte daran liegen, dass ja fast jedes Virus (Herpes mal ausgenommen) auch in der Lage ist, ins Genom zu integrieren und damit hätte man dann die Sequenzen. Wir sind voll mit Sequenzen, die eigentlich gar nicht artspezifisch und kodierend sind, ich würde das mit in dem Begriff der Koevolution unterbringen.


Firelion hat Folgendes geschrieben:
Das erinnert mich entfernt an die B/T- Zellrezeptoren. Ich stelle mir das jetzt so vor, dass die Pflsnze dann ja auf Verdacht durch ,, genetisches Lotto" die passenden kleinen RNAs bauen muss und gleichzeitig irgendwie screenen,


Mutagenese spielt da bestimmt eine nicht unbedeutende Rolle, nur hypervariable Sequenzbereiche wie bei den Antikörpern gibt es da nicht. Insofern hinkt der Vergleich, da die genannten Rezeptoren ja im Prinzip Antikörper sind.


Firelion hat Folgendes geschrieben:
Eine Frage: wäre das dann streng genommen ein GVO ? Bei dem Ansatz lässt man ja das Genom in Ruhe ?


Was bedeutet "GVO"?
Die Abkürzung ist mir nicht geläufig, aber ansonsten hast du recht, das Genom bleibt unaffektiert.

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Firelion



Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 10. Dez 2011 18:08    Titel: Antworten mit Zitat

GVO = Gentechnisch veränderter Organismus.
Stimmt die ganzen ERVs ( so heißen die doch oder ?) habe ich vergessen. Die sitzen meist in nicht codierenden Bereichen wie Repeats oder ?
Das Konzept des Gene silencing finde ich für die Tumortherapie interessant. Wenn man da irgendwann mal siRNA oder miRNA in den Tumor kriegen könnte und deren spzielle mRNA degenerien könnte. Das funktioniert dann aber ja auch nur primär mit Onkogenen. Aber bis dahin müsste man das steuern können, um die Genexpression nicht in Geweben zu stören wo sie nötig ist.

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Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
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BeitragVerfasst am: 10. Dez 2011 18:31    Titel: Antworten mit Zitat

Sorry, ich weiss auch nicht, was ERV bedeuten soll (habe es nicht so mit Abkürzungen...).
Aber ein gentechnisch veränderter Organismus wäre das nicht, da ein knockdown posttranskriptionell erfolgt.
Zudem hat RNA-Interferenz über siRNAs die Labore noch nicht verlassen, ich kenne noch kein Beispiel, in dem das erfolgreich in vivo angewendet wurde.
Also wäre es schon schwierig, überhaupt von Organismen zu sprechen, da es nur Zellen sind.
Wenn Zellen allerdings mit dem siRNA-Gen transfiziert oder über einen viralen Vektor transduziert würden, wären sie schon gentechnisch verändert.
Aber wie gesagt, das ist noch eine Domäne ausschliesslich der zellkultur.

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Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 10. Dez 2011 18:58    Titel: Antworten mit Zitat

Ah ich dachte es wäre schon weiter. Allerdings ist das ganze mit den regulatorischen RNAs ja auch neu.

ERV= Endogene Retroviren
Sorry, die Abkürzungen sind eine Unsitte, die ich mir in der Uni angewöhnt hab.

Dann müsste irgendwann das Gentechnikgesetz geändert werden, ansonsten bräuchte man ja für jeden Patienten eine Sicherheitsstufe. Könnte irgendwann noch interessant werden.

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Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
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BeitragVerfasst am: 10. Dez 2011 19:19    Titel: Antworten mit Zitat

Firelion hat Folgendes geschrieben:

Stimmt die ganzen ERVs ( so heißen die doch oder ?) habe ich vergessen. Die sitzen meist in nicht codierenden Bereichen wie Repeats oder ?


Nee, die können auch vollständig funktionierende mRNAs generieren, die werden meist nur noch im Zellkern degradiert. Wenn du das nukleäre Exosom mittels siRNA ausknockst, erhälst du stabile Transkripte. Manchmal kann man das ganz gut als Kontrolle verwenden, ob dein knockdown bestimmter Exosomenkomponenten auch effizient war (parallel zum Westernblot natürlich, nicht als Ersatz desselben).
Insofern IST schon jeder Mensch soweit, dass er eine Sicherheitsstufe bräuchte, denn wir sind evolutiv gesehen gentechnich verändertes Material, da viele Viren u.ä. Teile ihres Materials fest in unser genom "abgelegt" haben. Grins

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Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 10. Dez 2011 19:27    Titel: Antworten mit Zitat

Ah danke. Verrate das bloss nicht der Politik smile Sonst muss bald überall ein S1 oder S2 Schild hängen und wir dürften in Gegenwart anderer nicht mehr essen und trinken und müssten den ganzen Tag mit Kittel, Handschuhen und Schutzbrille rumlaufen Augenzwinkern
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Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 24. Okt 2012 13:31    Titel: Antworten mit Zitat

Hi,

ich hab noch eine Frage zur miRNA.
Diese ist im Gegensatz zur siRNA einsträngig.
Trotzdem werden beide von Dicer geschnitten und nur ein Strang bindet an die Argo- proteinen und bilden den RISC.
Bezieht sich das einsträngig dann darauf, dass die miRNA eine Sekundärstruktur mit Hairpins ausbildet und so doppelsträngige Bereiche ausbildet, während siRNA über die ganze Länge doppelsträngig ist?


LG und Danke
Firelion

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Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
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BeitragVerfasst am: 24. Okt 2012 20:20    Titel: Antworten mit Zitat

siRNAs werden eigentlich von Eukaryonten nicht endogen kodiert, sondern sind Intermediate von z.B. Viren. Dabei werden z.B. virale dsRNAs in kleine Teile zerheckselt und dienen dann als siRNAs.
miRNAs dagegen sind endogene Transkripte der PolII, die häufig in polycistronischen clustern auftreten, sie sind also polyadenyliert und tragen ein 5'-cap. Sie bilden Haarnadelstrukturen aus und werden in zwei Schritten prozessiert: 1. DROSHA erkennt die Stammschleifenstruktur des Primärtrankriptes, der sog. pri-miRNA und spaltet sie an der Stammschleife. Dadurch entstehen drei Fragmente: zwei einzelsträngige und eine Stammschleifenstruktur. Die Stammschleife ist die sog. prä-miRNA, die den Zellkern verlässt, um im Cytoplasma durch DICER prozessiert und als Einzelstränge auf den RISC-Komplex geladen zu werden.

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Anmeldungsdatum: 27.08.2009
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BeitragVerfasst am: 24. Okt 2012 20:25    Titel: Antworten mit Zitat

Ah Danke smile

Und siRNA werden auch in der Forschung gezielt eingebracht, binden vollständig komplementär an 1 Transkript und führen zur Degradation von diesem.
miRNA binden meist teilweise komplementärt manchmal auch vollständig komplementär an viele Transkripte und verringeren primär die Transkrtiption dieser durch Speicherung in p bodies können aber bei vollständiger Komplimentärität zur degradation der mRNA führen?
Zudem können miRNA je nach Gen, dass reguliert wird als Onkogen oder Tumorsupressor definiert werden ?

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Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 24. Okt 2012 20:42    Titel: Antworten mit Zitat

Firelion hat Folgendes geschrieben:

miRNA binden meist teilweise komplementärt manchmal auch vollständig komplementär an viele Transkripte und verringeren primär die Transkrtiption dieser durch Speicherung in p bodies können aber bei vollständiger Komplimentärität zur degradation der mRNA führen?


Hier meinst du Translation, nicht Transkription, oder?

Ja, das sagt man landläufig so, das letzte Wort ist hier aber noch nicht gesprochen. Häufig sind die Zielsequenzen von miRNAs eben doch sehr genau, so dass der Begriff "posttranskriptionelles silencing" auch hier anzuwenden wäre. Aber miRNAs sind noch nicht ausreichend charakterisiert, um hier abschliessende Urteile zu bilden.

siRNAs können übrigens auch Translationshemmer sein.

Firelion hat Folgendes geschrieben:
Zudem können miRNA je nach Gen, dass reguliert wird als Onkogen oder Tumorsupressor definiert werden ?


Das würde ich so nicht sagen. Ich würde eher argumentieren, dass miRNAs hochexprimiert werden, wenn z.B. ein Onkogen zu aktiv oder zu hoch exprimiert ist. Das Problem: Onkogene haben häufig die Zielsequenz für die entsprechende miRNA nicht mehr, da sie oftmals nicht mehr über die authentische 3'UTR verfügen bzw. die 3'UTR verkürzt ist. Somit ist ja die miRNA kein echtes Onko- oder Tumorsuppressorgen, da das Zielgen der RNAi-Regulation nicht mehr ausgesetzt ist.

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Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 24. Okt 2012 20:49    Titel: Antworten mit Zitat

Ah danke ich meinte Translation und nicht Transkription, ja schämen
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