RegistrierenRegistrieren    LoginLogin   FAQFAQ    SuchenSuchen   
DNA Isolation
 
Neue Frage »
Antworten »
    Foren-Übersicht -> Genetik
Autor Nachricht
Barney
Gast





BeitragVerfasst am: 29. Dez 2011 16:54    Titel: DNA Isolation Antworten mit Zitat

Hallo,

neulich haben wir Plasmid-DNA isoliert und jetzt sitze ich hier vor meinen Gelbildern (Gelelektrophorese) und weiß nicht recht, was genau die mir sagen sollen^^
Da ich nicht weiß, wie man hier Bilder einfügt versuche ich mal mein Problem zu erläutern. Wir haben von E.coli Plasmid-DNA isoliert und zwar haben wir das Zeug einmal so auf das Gel aufgetragen und dann noch eine andere Version, bei der wir RNAse mit dazugegeben haben...
Bei der Version ohne RNAse ist es bis ans Ende des Gels durchgelaufen, bei der mit RNAse nicht, sondern nur bis zur Hälfte... Warum? Ich bin grad irgendwie ratlos und weiß nicht wirklich, was das Gel mir sagen soll^^
Ich hoffe, dass das an Infos einigermaßen reicht (ich weiß, ist recht ungenau) und bin gespannt, ob jemand ein Tipp hat^^
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3551
Wohnort: Hannover

BeitragVerfasst am: 29. Dez 2011 18:13    Titel: Antworten mit Zitat

Das Ergebnis finde ich auch unlogisch. Außerdem wundert mich, dass du RNAase hinzugefügt hast.

Wenn du dich registrierst, kannst du auch (kleine) Bilder hochladen. Ansonsten gibt es andere Blattformen, bei denen man Bilder hochladen und hier verlinken kann.

_________________
Die deutsche Rechtschreibung ist Freeware, du darfst sie kostenlos nutzen. Aber sie ist nicht Open Source, d. h., du darfst sie nicht verändern oder in veränderter Form veröffentlichen.
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2109
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 30. Dez 2011 00:48    Titel: Antworten mit Zitat

PaGe hat Folgendes geschrieben:
Außerdem wundert mich, dass du RNAase hinzugefügt hast.


Wieso wundert dich das? Eigentlich gehört es zum Standardprotokoll bei Plasmidisolation, RNAse zuzugeben.

Was mich allerdings ebenso wundert, ist das Ergebnis.

@barney:
Hast du einen Grössenmarker mitgenommen? Welche Grösse sollte das Plasmid denn haben und welche Grösse hatten deine Banden? Was für ein Gel war das (TAE?)?
Welche Agarosekonzentration hast du gewählt? Wie hoch war die Spannung pro Zentimeter Laufstrecke? Und wie lange hast du das Gel laufen lassen?
Sind beide Proben in demselben Gel gelaufen? War in der Probe ohne RNAse die spezifische Bande gar nicht zu sehen (War die Bande der Probe mit RNAse überhaupt spezifisch?)?
Waren die Banden in beiden Fällen diskret? Wäre RNA-Kontermination eine Erklärung für das unterschiedliche Aussehen? Hast du daran gedacht, dass "supercoiled" Plasmide andere Laufeigenschaften aufweisen? Wäre Supercoiling eine Erklärung?

Ohne das Bild vor Augen zu haben, ist das schwer zu beurteilen.
Also: Am besten, du folgst PaGes Empfehlung, dich anzumelden oder das Bild woanders hochzuladen und hier damit zu verlinken und schreibst dazu, was für einem Protokoll du bei der Isolation sowie beim Gellauf gefolgt bist. Denn ansonsten kann jedes Urteil darüber nur spekulativer ausfallen, als dies auch unter Kenntniss aller Faktoren eh schon der Fall ist.

_________________
RNA?- just another nucleic acid?
Barney
Gast





BeitragVerfasst am: 30. Dez 2011 17:06    Titel: Antworten mit Zitat

Schonmal vielen Dank für eure Antworten! Werde mich dann denke ich mal anmelden und mich dann wieder melden, außerdem suche ich mal nach Antworten auf die Fragen von jörg in meinen Unterlagen^^
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3551
Wohnort: Hannover

BeitragVerfasst am: 30. Dez 2011 17:47    Titel: Antworten mit Zitat

Wenn das Plasmid schon isoliert ist, ist die Zugabe von RNAse eigentlich unsinnig. Wie du schreibst, gibt man es bei der Isolation hinzu. Ansonsten dürfte die Extraktion auch deutlich ineffektiver sein.

Dem Eingangspost habe ich zumindest nicht so gelesen, dass es zwei unterschiedliche Extraktionen waren, sondern ein Ansatz mit isolierten Plasmid "verdaut" werden sollte.
Wenn es allerdings eine DNAse war, passen Versuch und Ergebnis wieder zusammen. Das Ziel finde ich aber komisch, was aber bei "didaktischen" Versuchen nichts zu bedeuten hat.

_________________
Die deutsche Rechtschreibung ist Freeware, du darfst sie kostenlos nutzen. Aber sie ist nicht Open Source, d. h., du darfst sie nicht verändern oder in veränderter Form veröffentlichen.
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2109
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 30. Dez 2011 19:45    Titel: Antworten mit Zitat

Oh, hast recht, da steht tatsächlich, dass die RNAse vor dem Gellauf hinzugegeben wurde schämen

Sorry...

_________________
RNA?- just another nucleic acid?
Neon



Anmeldungsdatum: 02.01.2012
Beiträge: 9

BeitragVerfasst am: 02. Jan 2012 14:48    Titel: Antworten mit Zitat

So, da bin ich wieder, diesmal angemeldet... (ehemals Barney)

Ich hoffe, dass es klappt, wenn ich die bilder unten als Anhang ranpacke. Die Verläufe, wo 5 dünne Banden zu sehen sind, ist der Marker und die anderen sind die Verläufe von versch. Versuchsgruppen (sehen ja alle gleich aus, außer bei dem Plasmid MIT RNAse das erste, das ist aber nicht wichtig).
Ich hoffe, jetzt klappt das mit einem Tipp, bin nämlich noch immer recht ratlos...

lg Neon Thumbs up!

EDIT: Ja, die RNAse wurde ganz am Schluss hinzugegeben. Wir haben isoliert und dann die eine Hälfte aufs Gel gegeben und in die andere Hälfte RNAse rein, gewartet und dann auch aufs Gel. Aber warum erschließt sich mir nicht^^ (Und es war ganz sicher RNAse)



Plasmid DNA ohne RNAse.JPG
 Beschreibung:
 Dateigröße:  9.13 KB
 Angeschaut:  10158 mal

Plasmid DNA ohne RNAse.JPG



Plasmid DNA mit RNAse.JPG
 Beschreibung:
 Dateigröße:  9.12 KB
 Angeschaut:  10158 mal

Plasmid DNA mit RNAse.JPG


jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2109
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 02. Jan 2012 15:50    Titel: Antworten mit Zitat

Neon hat Folgendes geschrieben:
außer bei dem Plasmid MIT RNAse das erste, das ist aber nicht wichtig


Warum ist das nicht wichtig?

Zumindest hast du da alle Banden, die in den anderen Proben enthalten sind.
Warum hast du überhaupt verschiedene Banden in einer Probe?
Wie hast du die Plasmide präpariert? Hast du während der Isolation auch RNAse zugegeben? Oder soll hier RNA-Kontermination demonstriert werden? Dann allerdings wunderte es mich, dass die Banden dafür doch recht diskret sind.... grübelnd

Es wäre hilfreich, etwas über das Isolationsprotokoll zu erfahren und die Art der Probenaufbereitung. Und wie gross ist denn dein Plasmid? Welche Grössen repräsentiert der Marker?

_________________
RNA?- just another nucleic acid?
Neon



Anmeldungsdatum: 02.01.2012
Beiträge: 9

BeitragVerfasst am: 02. Jan 2012 16:18    Titel: Antworten mit Zitat

Der eine Verlauf ist für mich persönlich nicht wichtig, da ich speziell zu dem nichts notieren muss ;-) Es sind mehrere Verläufe zu sehen, da auch andere aus dem Kurs das Gleiche gemacht haben und bei den meisten sieht es so aus, wie bei mir.

Also zum Verlauf der isolation: zuerst haben durch Zugabe (natürlich nicht auf einmal^^) NaOH , SDS und NaAc die "normale" DNA entfernt, dass nur noch die Plasmid-DNA übrig bleibt (so stehts hier zumindest). Dann haben wir noch EtOH zugegeben, um irgendwelches Salz auszuwaschen zugegeben^^ Ja, dann war das Plasmid ja soweit eigentlich isoliert und Ladepuffer wurde zugegeben und aufs Gel aufgetragen. Und zum anderen Teil halt noch RNAse und dann erst Ladepuffer... Erst am Ende wurde RNAse zugegeben, sonst nicht. Ich weiß leider nicht, was für ein Ladepuffer, falls das wichtig sein könnte)

Wegen der RNA kontamination: Ich habe mir notiert, dass das leuchtende am ende RNA ist, die da eigentlich nicht so vorhanden sein sollte...

EDIT: Wie groß das Plasmid sein soll, weiß ich leider gar nicht^^
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3551
Wohnort: Hannover

BeitragVerfasst am: 02. Jan 2012 16:40    Titel: Antworten mit Zitat

Die "unwichtige" Bahn finde ich insofern interessant, dass es eine Symbiose aus Ansatz 1 und 2 ist => unvollständiger Verdau.

Die Änderung muss ja auf die RNAse zurückgeführt werden. Nun ist die Frage, ob es ein DNA-RNA-Hybrid ist, was so herlich strahlt oder nur RNA und die DNA an ihrer eigentlichen Stelle (evtl. durch Hybridbildung etwas verschoben => stärkere Schlieren) liegt. Ich tippe mal auf letzteres, da der Marker leicht unterschiedlich hell ist und die vorherige starke Banden noch beim RNAse-Gel bei der Bahn 1 deutlich und Bahn 4 leicht zu sehen ist. Außerdem scheint die Markierung vom Laufpuffer (blaue Bande) beim ersten Bild etwas blaßer, wobei das auch an der starken Strahlung der Bande liegen kann.

Ein Grund, weshalb ein DNA-RNA-Hybrid schneller laufen sollte, fällt mir nicht ein.

_________________
Die deutsche Rechtschreibung ist Freeware, du darfst sie kostenlos nutzen. Aber sie ist nicht Open Source, d. h., du darfst sie nicht verändern oder in veränderter Form veröffentlichen.
Neon



Anmeldungsdatum: 02.01.2012
Beiträge: 9

BeitragVerfasst am: 02. Jan 2012 16:55    Titel: Antworten mit Zitat

Ich bin ehrlich gesagt etwas durcheinander.
Also erstmal: Warum ist da eigentlich überhaupt noch RNA drin? Ich dachte ich hätte wirklich nur die Plasmid-DNA isoliert?! Ich hoffe das ist jetzt keine blöde Frage?!^^

Und ich meine auch mir notiert zu haben, dass das nur RNA ist, die da so vor sich hin leuchtet. Allerdings habe ich deine Erklärung nicht wirklich verstanden. Wegen den schlieren (also die nicht zu sehenden Banden^^) hatte ich mir durch zusammenhängende offenkettige, zirkuläre und diese supercoiled form erklärt, da die ja unterschiedlich weit laufen, dass man deswegen einfach nichts erkennen kann, weil die alle zusammenhängen, weil vielleicht zuviel Probe genommen wurde. Aber auf die unterschiedlich weiten Laufwege in Zusammenhang mit RNA komme ich irgendwie nicht klar ;-)
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3551
Wohnort: Hannover

BeitragVerfasst am: 02. Jan 2012 17:22    Titel: Antworten mit Zitat

Durch das Verfahren kannst du Nukleinsäuren isolieren. RNA und DNA unterscheiden sich doch kaum. Sehr kurze RNA-Stücke kannst du mit der Methode wahrscheinlich nicht ausfällen und isolieren, aber es gibt ja genug mRNA und tRNA.

Die diskreten Banden sind sicherlich die 3 Formen eines Plasmids. Allerdings würde ich sagen, dass es oben noch etwas schmieriger ist. Brauchst du aber nicht in dein Protokoll aufzunehmen.

_________________
Die deutsche Rechtschreibung ist Freeware, du darfst sie kostenlos nutzen. Aber sie ist nicht Open Source, d. h., du darfst sie nicht verändern oder in veränderter Form veröffentlichen.
Neon



Anmeldungsdatum: 02.01.2012
Beiträge: 9

BeitragVerfasst am: 02. Jan 2012 17:29    Titel: Antworten mit Zitat

Also könnte ich quasi sagen, dass die RNA weiter läuft, als die DNA... und als die RNA durch die RNAse erledigt wurde nur noch die DNA da ist, die ja nicht soweit läuft (nur bis zur Hälfte)...bis auf ein paar kleine Ausnahmen?!?!

Und das soll die Aussage vom Experiment sein? grübelnd Oder hab ichs immer noch nicht verstanden? Grins
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3551
Wohnort: Hannover

BeitragVerfasst am: 02. Jan 2012 17:57    Titel: Antworten mit Zitat

Du hast die RNA so klein gehexelt, dass sie entweder aus dem Gel rausgelaufen ist oder so klein ist, dass kein Ethidiumbromid mehr einlagern kann. => Unsichtbar. Wenn man es bei der Präparation bereits hinzugibt, dürften sie wahrscheinlich bei der Präp gar nicht in der Endlösung sein.

Die RNA ist kürzer als das Plasmid. Daher wandert sie auch weiter.

Was der Leiter damit bezwecken wollte? Wahrscheinlich nur: Vergesst die RNAse nicht bei der Extraktion, sonst dürft ihr alles nochmal machen. Bei Baktis geht das ja relativ schnell, wenn du dann aber in den eukaryotischen Bereich gehst, kann das mal git einen Monat Arbeit zunichte machen.

_________________
Die deutsche Rechtschreibung ist Freeware, du darfst sie kostenlos nutzen. Aber sie ist nicht Open Source, d. h., du darfst sie nicht verändern oder in veränderter Form veröffentlichen.
Neon



Anmeldungsdatum: 02.01.2012
Beiträge: 9

BeitragVerfasst am: 02. Jan 2012 18:07    Titel: Antworten mit Zitat

Ok, ich glaub ich habs jetzt verstanden... Dann mach ich mich mal an meinen Bericht... falls ich doch noch über was stolpern sollte frag ich einfach nochmal^^

Auf jeden Fall vielen vielen Dank für deine Hilfe!!! Thumbs up!
Neon



Anmeldungsdatum: 02.01.2012
Beiträge: 9

BeitragVerfasst am: 04. Jan 2012 12:20    Titel: Antworten mit Zitat

Jetzt habe ich doch noch eine kurze Frage:
Was ist denn das, was bei dem Gel mit RNAse da so stark hell leuchtet? RNA kanns ja nicht sein, die wurde ja von der RNAse niedergemacht. Ist das dann ganz einfach DNA und davon ganzschön viel, weil z.B. zuviel Probe vorhanden war? Oder noch was anderes? Weil es kann ja eigentlich nur RNA oder DNA sein?!

Schonmal vielen Dank im voraus!

Lg
Neon
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3551
Wohnort: Hannover

BeitragVerfasst am: 04. Jan 2012 13:13    Titel: Antworten mit Zitat

Es ist DNA. Ich weiß nicht, ob RNA das Anfärben mit Ethidiumbromid behindert (glaube eher nicht). Und die Signalstärke beider Gele kann man nur begrenzt vergleichen, da unterschiedliche Probenmengen genommen worden sein könnten, unterschiedlich stark angefärbt worden sein konnte oder unterschiedlich stark bestrahlt/belichtet wurde.
_________________
Die deutsche Rechtschreibung ist Freeware, du darfst sie kostenlos nutzen. Aber sie ist nicht Open Source, d. h., du darfst sie nicht verändern oder in veränderter Form veröffentlichen.
Neue Frage »
Antworten »
    Foren-Übersicht -> Genetik

Verwandte Themen - die Neuesten
 Themen   Antworten   Autor   Aufrufe   Letzter Beitrag 
Keine neuen Beiträge DNA, Antibiotika 3 MR 199 11. Mai 2021 13:05
Bio-Gast Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge Von der DNA zum Merkmal ein Begriffsnetz 0 Annanas 3598 15. Okt 2019 11:38
Annanas Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge Verändert sich sich die DNA? Stammzelltransplantation 0 Gast 2053 02. Jan 2019 10:14
Anolised Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge Dna Replikation - Dna Polymerase 2 Gast 3729 10. Okt 2018 10:36
Blipt1960 Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge Human DNA vs. other species 0 JoeClark 5323 23. Nov 2017 06:37
JoeClark Letzten Beitrag anzeigen
 

Verwandte Themen - die Größten
 Themen   Antworten   Autor   Aufrufe   Letzter Beitrag 
Keine neuen Beiträge DNA/DNS 21 simsespätzle 22958 23. Nov 2005 21:51
chefin Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge DNA - was kann man alles in ihr lesen ??? 16 Jens 13802 23. Aug 2005 20:26
Karon Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge DNA aus Codesonne ablesen? 14 Gast 28626 09. Feb 2010 20:02
PaGe Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge DNA bei roten blutkörperschen 14 FatRandy 14416 25. Nov 2008 19:47
FatRandy Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge DNA Replikation 12 DNA-Gen 3226 29. Dez 2016 03:56
jörg Letzten Beitrag anzeigen
 

Verwandte Themen - die Beliebtesten
 Themen   Antworten   Autor   Aufrufe   Letzter Beitrag 
Keine neuen Beiträge DNA in m-RNA und t-RNA umwandeln - Aufgabe 10 ketzchen 73622 16. Jan 2017 15:50
PaGe Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge Unterschied zwischen RNA und DNA? 3 Cedro 35382 16. Apr 2010 19:02
PaGe Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge Aufbau der DNA 5 Zilla 35046 08. Nov 2010 22:35
nanana Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge DNA aus Codesonne ablesen? 14 Gast 28626 09. Feb 2010 20:02
PaGe Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge DNA/DNS 21 simsespätzle 22958 23. Nov 2005 21:51
chefin Letzten Beitrag anzeigen