| Autor |
Nachricht |
a.M
Anmeldungsdatum: 19.09.2011
Beiträge: 38
|
 Verfasst am: 12. Apr 2012 14:04 Titel: genetischer Fingerabdruck |
 |
|
Hallo zsm!
ich sitzte grade über "dem genetischen Fingerabdruck" und stelle mir noch einige Fragen... ich hoffe hier kann mir jemand weiterhelfen... danke
Es gibt ja genetische Marker (VNTRs, STRs und SNPs), die von Individuum zu individuum unterschiedlich sind. Beim genetischen Fingerabdruck betrachtet man dann die länge Tandems.
-Wenn man dann zum Beispiel ein hexa-tandem hat, wird das dann "ausgeschnitten"(also der Rest wird "entsorgt")?
-Passiert das dann vor der PCR?
-Werden die durch die Restriktionsenzyme erkannt und mit hilfe dieser "ausgeschnitten"? (oder ist das nur bei den RFLPs, die durch bestimmte speziale Sequenzen/palindrome erkannt werden [gibt es einen zusammenhang zwischen RFLP und VNTS/STR/SNP?])
-bei der RFLP-Analyse: gibt es da zwei möglichkeiten?
1.:vorher gefärbt mit Bromphenlblau
und 2.:"Southern Blotting", also radioaktive markierung [werden dann die ddn nucleotide nach SANGERS methode markiert?])
ich hoffe ihr könnt mir helfen! Danke und Liebe Grüße |
|
 |
Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
|
| Verfasst am: 12. Apr 2012 16:54 Titel: |
|
|
Hi,
zur Markierung:
Du kannst die ddNTPs auch mit floureszierenden Farbstoffen markieren. Das ist dann weniger problematisch.
Ansonsten kannst du die interessierenden Repeats gezielt mit der PCR verfielfältigen indem du Primer nimmst die diese Bereiche flankieren. Dann wird nur der interessierende Abschnitt verfielfältigt.
LG Firelion
_________________
It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
|
|
a.M
Anmeldungsdatum: 19.09.2011
Beiträge: 38
|
| Verfasst am: 12. Apr 2012 17:03 Titel: |
|
|
hey.. danke schoneinmal! 
bezieht sich das aufs southern blotting??
also nach sanger werden dann die abbruch nucleotide mit farbstoff markiert (das passiert ja in jeweiligen RGs) werden die dann wieder zusammengeschüttet oder wird jede probe in eine lasche gefüllt und dann die elektrophorese durchgeführt?
wenn einzeln erhält man ja viele "bahnen", aber pro dna wird doch eig nur eine "bahn " analysiert .. :? |
|
|
jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
|
| Verfasst am: 12. Apr 2012 20:25 Titel: Re: genetischer Fingerabdruck |
|
|
| a.M hat Folgendes geschrieben: |
-Wenn man dann zum Beispiel ein hexa-tandem hat, wird das dann "ausgeschnitten"(also der Rest wird "entsorgt")?
-Passiert das dann vor der PCR?
-Werden die durch die Restriktionsenzyme erkannt und mit hilfe dieser "ausgeschnitten"? (oder ist das nur bei den RFLPs, die durch bestimmte speziale Sequenzen/palindrome erkannt werden |
Hier habe ich leider keine Ahnung, worauf du konkret hinausmöchtest, doch wenn du deine Gedanken etwas ausführlicher darstelltest, werde ich gerne dazu Stellung nehmen.
| a.M hat Folgendes geschrieben: | | gibt es einen zusammenhang zwischen RFLP und VNTS/STR/SNP? |
Ja und Nein. Verschieden lange repetitive Sequenzen erzeugen auch verschiedene Restriktionsfragmentlängen. Doch auch und vor allem das Vorhandensein bzw. Nicht-Vorhandensein bestimmter Restriktionsschnittstellen erzeugt die verschiedenen Fragmentlängen.
| a.M hat Folgendes geschrieben: | bei der RFLP-Analyse: gibt es da zwei möglichkeiten?
1.:vorher gefärbt mit Bromphenlblau
und 2.:"Southern Blotting", also radioaktive markierung [werden dann die ddn nucleotide nach SANGERS methode markiert?] |
Mit der Sanger-Methode hat das erst mal wenig zu tun, du markierst die Sonden radioaktiv. Erkläre doch einmal, was ein Southern-Blot eigentlich ist und warum man nicht einfach ein Ethidiumbromidgel laufen lassen und sich das darin anschauen kann.
Dann erkläre einmal die Kettenabbruchmethode und wozu sie eingesetzt wird.
Das hilft dann auch bei diesem Problem:
| a.M hat Folgendes geschrieben: |
also nach sanger werden dann die abbruch nucleotide mit farbstoff markiert (das passiert ja in jeweiligen RGs) werden die dann wieder zusammengeschüttet oder wird jede probe in eine lasche gefüllt und dann die elektrophorese durchgeführt?
wenn einzeln erhält man ja viele "bahnen", aber pro dna wird doch eig nur eine "bahn " analysiert .. :? |
_________________
RNA?- just another nucleic acid? |
|
|
a.M
Anmeldungsdatum: 19.09.2011
Beiträge: 38
|
| Verfasst am: 12. Apr 2012 21:49 Titel: |
|
|
hallo jörg.. danke wiedereinmal für deine Hilfe!
zu dem 1.:
es gibt ja tandems, also wiederholungssequenzen. Frage ist zum "herausbekommen", also: gibt es dann Primer (oder sind das die restriktionsenzyme), die (soweit ich das richtig verstanden hab rahmet eine bestimmte basenabfolge die tandems ein (also am anfang und am ende) nur diese stelle synthetisieren? also werden nur diese tandems bei der PCR vervielfältigt? wenn dann bestimmte restriktionsenzyme schneiden könnten, dann tuen sie dies, aber nachher. (habe ich das richtig verstanden?)
zu 2.:
sind RFLPs auch genetische Marker, wie die anderen ?! (nur hier gibt es dann keine tandems, sonderrn eben speziale palindrome für die restriktionsenzyme?)
und das gleiche bei den SNPs (punktmutationen), weil dort dann ggf ein palindrom entstehen oder wegfallen kann. (stimmt das so?)
zu 3.:
ich habe eine abbildung (ich weiß nur nicht, wie man die hier einfügen kann): oben die "kettenabbruchmethode nach Sanger" darunter "automatiosche sequenzierung mit fluorszenzfarbstoffen".. die abb. "kettenabbruch..." endet mit einem bild einer elektrophorese, andenen jeweils adenin, cytosin, guanin und thymin eine "laufbahn" haben und dann eben iwo ihre Bande "machen"... dann bedinnt die Abb. "automatische Sequenzierung.." mit einer einzigen "Laufbahn" in unterschiedlichen farben (iwie logisch, dass das die nucleotide darstellt) ...ABER: ich verstehe den zusammenhang nicht: Wie kommt man von den viel "laufbahnen" auf eine (sodass man bei einem genetischen fingerabdruck sozusagen eine person=1 "laufbahn" hat?) und ... werden bei Sanger die Abbruchnucleotide jetzt fluoresziert oder nicht??
Bromphenolblau bei der VNTR-Methode (agarose-gelelektrophorese) und radioaktiv markiert bei RFLP-Analyse??? (stimmt das jetzt??)
zu 4.:
"was ein Southern-Blot eigentlich ist und warum man nicht einfach ein Ethidiumbromidgel laufen lassen und sich das darin anschauen kann."
southern-Blot ist doch: mithilfe von radioaktiven sonden, welche an dna binden und dann sozusagen den kompementären strang bilden, (+uv-licht) werden diese Bindungen schwarz dargestellt (=autographie) (wenn ich es richtig verstanden habe.. :?)
"Dann erkläre einmal die Kettenabbruchmethode und wozu sie eingesetzt wird"
da will man die unbekannte basenabfolge herausfinden. dazu abbruchnucleotide, die dann an den zu synthetisierenden strang setzten und abbrechen.so erhält man auch unterschiedlich lange fragmente, die somit auch unterschiedliche banden bilden (bei elektrophorese)
aber in beiden fällen finde ich ja (individuelle) fragmente heraus, die individuelle bandenmuster für ein individuum erstellen...(nur dass es bei der "abbruch.." pro nucleotid eine "laufbahn" gibt und keine einzelne) ->deshalb frage ich mich, ob man die, wenn floureszeriert und Fragmente in RGs enthalten sind (also Abbruch stattgefunden) man alles zusammenschüttet und dann mit der Gelelektrophorese auf einer Bahn so was schönes buntes hat wie bei der "automatischen sequenzierung.." :?
das wäre bisher alles.. :X
Liebe Grüße und Danke |
|
|
Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
|
| Verfasst am: 12. Apr 2012 21:56 Titel: |
|
|
Zu drei:
Du musst sehen was Sanger gemacht hat. Der hast die ddNTPS mit radioaktiv markiert. Das heißt er konnte zwar den Abbrauch sichtbar machen, aber der sehe füpr die vier Nukleotide gleich aus. So kannst du natürlich nicht sequenzieren. Deswegen hat man vier RG gebommen und hat in jedes RG nur ein markiertes ddNTP geworfen. Jedes RG wurde dann getrennt auf eine Bahn gegeben und die Elektrogelelektrophorese laufen gelassen. Dann weißt du für jede Bashn welches das letzte Nukleotid ist. Wenn du dann das jeweils kürzeste Segment der Bahn nimmst um die Sequenz zusammenzubasteln, kommst du am Ende auf eine ,,Bahn".
Im gegensatz dazu nimmt masn heute Floureszenzfarbstoffe: die sind ungefährlicher, billiger und leichter zu entsorgen. Und es gibt die sogar in vier Farben. Das heißt du markierst jedes ddNTP in einer anderen Farbe. Jetzt kannst du an der Farbe das ddNTP wieder erkennen. Deswegen kannst du auch alle vier ddNTPs in das selbe RG kippen und erhälst nur eine Bahn.
_________________
It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
|
|
a.M
Anmeldungsdatum: 19.09.2011
Beiträge: 38
|
| Verfasst am: 13. Apr 2012 09:07 Titel: |
|
|
guten morgen
vielen dank! das habe ich jetzt verstanden 
aber was ist damit: "Bromphenolblau bei der VNTR-Methode (agarose-gelelektrophorese) und radioaktiv markiert bei RFLP-Analyse??? (stimmt das jetzt??)"
schön wäre, wenn ihr mir noch bei den anderen Fragen weiterhelfen könntet..
LG |
|
|
jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
|
| Verfasst am: 13. Apr 2012 19:10 Titel: |
|
|
| a.M hat Folgendes geschrieben: |
aber was ist damit: "Bromphenolblau bei der VNTR-Methode (agarose-gelelektrophorese) und radioaktiv markiert bei RFLP-Analyse??? (stimmt das jetzt??)" |
Ich weiss nicht so recht, warum du immer mit Bromphenolblau kommst und über die Art der Färbung einen Unterschied bezüglich der Methoden herstellst. Bromphenolblau ist ein Farbmarker, der bei der Elektrophorese verwendet wird, ja, aber damit spezifisch DNA anzufärben ist nach meinem Wissen unüblich.
Ausserdem scheint mir, dass du den Unterschied der Methoden gar nicht so genau kennst, deswegen ersteinmal ein paar ganz allgemeine Anmerkungen in Form von verschiedenen Szenarien.
Szenario 1:
Du hast extrem viel DNA (so aus ca. 500 000 Zellen). Die kannst du direkt mit Restriktionsenzymen verdauen und auf ein Gel auftragen. Das Problem ist, dass du dann einen Schmier hast, der sich über das ganze Gel zieht, wenn du es mit Ethidiumbromid unspezifisch färbst. Deswegen transferierst du die DNA auf eine Nylonmembran (Southern-Blot) und detektierst definierte Abschnitte mit spezifischen, markierten DNA-Sonden. Die Sonden sind Sequenzen, die komplementär zu konservierten Sequenzen sind, also bei allen Menschen gleich. Hier bieten sich besonders sich wiederholende Sequenzen an, also sog. repeats (STR oder VNTR). Die Markierung erfolgt entweder radioaktiv (dann markierst du die Sonden radioaktiv) oder mittels einer Farbreaktion.
Was du nutzt, ist ziemlich egal, ich mache solche Sachen radioaktiv.
Dann hast du bei verschiedenen Individuen Banden, die bei verschiedenen Grössen laufen, da du ja deine DNA der Grösse nach in der Elektrophorese aufgetrennt hast. Auch ein einzelnes Individuum hat Banden verschiedener Grösse, es sei denn, es hat vom Vater und der Mutter das gleiche Allel erhalten.
Nun können diese verschiedenen Bandengössen (die ja jeweils ein aus dem Chromosom herausgeschnittenes Stück repräsentieren) durch zweierlei Umstände entstehen: Zum einen kann es sein, dass eine Schnittstelle auf dem einen Chromosom vorhanden ist, aber auf dem anderen nicht. Zum anderen kann es sein, dass die Anzahl der Repeats, also der Wiederholungssequenzen unterschiedlich ist und dadurch die verschiedenen Bandenlängen entstehen.
Dieses ganze beschreibt die RFLP-Analyse.
Meistens liegt aber meistens nicht so viel DNA vor, womit wir bei Szenario 2 wären:
Du hast also wenig DNA (z.B. eine minimale Blutspur). Nun musst du diese vervielfältigen. Das machst du mit einer PCR. Dabei wählst du die Primer so, dass sie möglichst eine repetitive Sequenz (also STR oder VNTR) flankieren. Nun wählst du sie auch noch so, dass zwischen jedem Primer und der Wiederholungssequenz eine Restriktionsschnittstelle liegt. Dann schneidest du dein PCR-Produkt mit den entsprechenden Restriktionsenzymen.
Du hast dann nun Fragment vervielfältigt (das wird natürlich mit ganz vielen Primern gemacht und du erhälst dann ganz viele Fragmente unterschiedlicher Grösse), dass bei einem Individuum in zwei verschiedenen Längen vorliegt, von denen jede die Erbschaft eines Elternteiles repräsentiert. Die unterschiedlichen Längen entstehen durch die unterschiedliche Anzahl der Wiederholungen in der repetitiven Sequenz des mütterlichen und des väterlichen Erbgutes. Dieses brauchst du nun nicht zu blotten und spezifisch zu markieren, weil du auf deinem Elektrophoresegel ja keinen Schmier hast, sondern zwei diskrete Banden, die du mit Ethidiumbromid anfärben kannst.
Hier reicht eine unspezifische Färbung, weil du ja bereits die spezifität durch die Primerwahl festgelegt hast. Dann kannst du, wenn es dich interessiert, diese Banden ausschneiden und mit z.B. der Kettenabbruchmethode sequenzieren.
Ich glaube, mit diesem kleinen Aufsatz auf alle Fragen eingegangen zu sein.
Sollte sich die ein oder andere doch nicht erübrigt haben, meld dich einfach nochmal.
Aber was genau ein Southern-Blot ist, was du über die PCR weisst und wie die Kettenabbruchmethode funktioniert, hast du immer noch nicht wirklich beschrieben. Du hast dazu ein paar kryptische Informationen aufgeschrieben, die jedoch keine Beurteilung erlauben, ob du mit diesen Methoden tatsächlich etwas anfangen kannst.
edit: Ich habe dir gerade nochmal zwei Seiten rausgesucht, die du mal durchstöbern kannst, da scheint das nach kurzem Überfliegen mit ausreichender Vollständigkeit dargestellt:
http://www.schule-bw.de/unterricht/faecher/biologie/material/zelle/lutz/PCR_Script.pdf
http://www.biovalley-college.net/Materialen/U-Materialen/NAT-Working/NAT-Working_DNA-&Proteinfingerprint.pdf
_________________
RNA?- just another nucleic acid? |
|
|
a.M
Anmeldungsdatum: 19.09.2011
Beiträge: 38
|
| Verfasst am: 13. Apr 2012 19:47 Titel: |
|
|
hallo!
danke! ..
den ersten link bekomme ich nicht geöffnet, aber die Antwort war ja ziemlich umfangreich...
ich denke ich habe das grundsätzlich ersteimal verstanden... nur eine klitzekleine frage..:
bei der besagten RFLP-Analyse
beginne ich mit den Restriktionsenzymen (weil ja kopieren keinen sinn macht, schließlich hab man genug dna vorliegen)
die zerschneiden, sodass für menschen individuell lande fragmente entstehen
..dann ?.. noch keine Elektrophorese, weil sonst nur schlieren!
..sondern?.. southern blotting (mit alkanischer denaturierung, radioaktiven primern, die (für alle menschen gleich) an komplementäre sequenzen binden.
dann erhällt man am ende ein bandenmuster (individuelles)
bisher dachte ich dazwischen kommt noch die "Abbruchreaktion (sanger)" bzw "fluoreszenz.."(sanger-coulson)..
..(ist das prinzipiell möglich, wenn man die SEQUENZ der Basen (als z.B. ATTGCAGTC...) haben will? oder ist das völlig fehl am Platze??
->dann: wo baue ich das dann ein??(schließlich steht dies unter dem thema genetischer Fingerabdruck)
LG |
|
|
Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
|
| Verfasst am: 13. Apr 2012 19:52 Titel: |
|
|
Hmm
Sanger dient der Sequenzierung das heißt du wiollst die ganz genaue Basenabfolge wissen. Bei der RFLP Methode geht es meines Wissens nach aber nur um die Länge dieser Fragmente. Dafür müsste dann die Auftrennung im Gel ausreichend sein.
@ jörg: Muss man dafür radioaktiv markierte Sonden nehmern oder tun es auch hier die Floureszenz markierten ?
EDIT: Sequenzieren tut man meines wissens nach nur für die Diagnostik, weil man so Punktmutationen aufspüren kann.
Für den genetischen Fingerabdruck/Vaterschaftstest ist es aber verboten codierende Abschnitte der DNA zu untersuchen, weil es eben niemanden etwas angeht ob die Person x später einmal Chorea Huntington bekommt odermit 80% Wahrscheinlichkeit depressiv ist.
_________________
It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
|
|
a.M
Anmeldungsdatum: 19.09.2011
Beiträge: 38
|
| Verfasst am: 13. Apr 2012 20:06 Titel: |
|
|
aaaaahhaaa.. okay.. vielen dank!
ich hatte mich schon leicht gewundert, wieso man da die Basenabfolge rausbekommmt, wenn es eigentlich um diese Banden geht...
thx
also "meines wissens" nach ist das nur radioaktiv, weil ja die primer markiert werden und nicht die Basen (und eine Farbe reicht ja dann auch aus, wenn man nur die Banden haben will)
LG |
|
|
Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
|
| Verfasst am: 13. Apr 2012 20:10 Titel: |
|
|
Naja,
theoretisch müsste auch ein floureszierendes Label an den Primer gehen.
Die Arbeit mit Radioaktivität wird möglichst vermieden da das schon ein Aufwand ist von wegen Dosimeter, Strahlenschutzbeauftragte, Entsorgung...
_________________
It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
|
|
jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
|
| Verfasst am: 13. Apr 2012 20:17 Titel: |
|
|
| a.M hat Folgendes geschrieben: |
bei der besagten RFLP-Analyse
beginne ich mit den Restriktionsenzymen (weil ja kopieren keinen sinn macht, schließlich hab man genug dna vorliegen)
die zerschneiden, sodass für menschen individuell lande fragmente entstehen
..dann ?.. noch keine Elektrophorese, weil sonst nur schlieren!
..sondern?.. southern blotting (mit alkanischer denaturierung, radioaktiven primern, die (für alle menschen gleich) an komplementäre sequenzen binden. |
Wie willst du einen Southern-Blot ohne Elektrophorese durchführen?
Du kannst halt das Gel nur nicht unspezifisch anfärben, weil du dann nur Schmier siehst, sondern musst gezielt einzelne Banden nachweisen.
Nun erkläre doch einmal bitte, was ein Southern-Blot ist, sonst kommen wir hier nicht weiter.
| a.M hat Folgendes geschrieben: | | wo baue ich das dann ein?? |
Weiss ich auch nicht, eigentlich gehört das nicht zu den üblichen Techniken des genetischen Fingerabdruckes.
| Firelion hat Folgendes geschrieben: |
@ jörg: Muss man dafür radioaktiv markierte Sonden nehmern oder tun es auch hier die Floureszenz markierten ? |
Es gibt auch Farbsonden, ob allerdings Floureszens eingesetzt wird, weiss ich nicht, wie gesagt, ich arbeite bei Blots prinzipiell radioaktiv, ist das sensitivste.
| a.M hat Folgendes geschrieben: |
also "meines wissens" nach ist das nur radioaktiv, weil ja die primer markiert werden und nicht die Basen (und eine Farbe reicht ja dann auch aus, wenn man nur die Banden haben will) |
Die Primer werden in der Regel nicht markiert, warum auch?
Die Banden machst du dann im Elektrophoresegel sichtbar oder blottest sie, dann werden die Sonden markiert.
Verwechsele nicht die Sonden (Blot) mit den Primern (PCR).
Aber da hier noch Unsicherheiten bestehen, solltest du wirklich einmal erklären, was du über die Methoden Southern-Blot und PCR weisst, sonst bleiben solche Verwechselungen bestehen.
| Firelion hat Folgendes geschrieben: |
theoretisch müsste auch ein floureszierendes Label an den Primer gehen. |
Du möchtest auch die Primer markieren? Warum nur? Gibt es da was, von dem ich nichts weiss?
Bitte um Aufklärung 
_________________
RNA?- just another nucleic acid? |
|
|
Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
|
| Verfasst am: 13. Apr 2012 20:19 Titel: |
|
|
Sorry war durcheinander.
Nein, nicht die Primer sondern die Sonden.
_________________
It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
|
|
a.M
Anmeldungsdatum: 19.09.2011
Beiträge: 38
|
| Verfasst am: 13. Apr 2012 20:28 Titel: |
|
|
also zu southern blotting habe ich das:
1. Restriktionsfragmente von der gelplatte auf die Trägermembran (zb nylon) übertragen
2. Banden fixiert durch(?) alkalien (welche gleichzeitig(?) denaturieren)
3. (hybridisierung) zugabe von radioaktiven gensonden (oder eben wie du meintest flouresziert geht auch) und gensonden sind bei allen menschlichen-dna-proben gleich
4.gensonden binden komlementär mit dna-fragmenten
5. trägermembran auf radioaktive strahlung empfindlichen film gelegt
6.autoradiographie: schwärzung (bei entwickung des films) identifiziert diese hybridisierungsstellen -> bandenmuster
jetzt noch mal diese frage zum verständnis:
ich habe restriktionsfragmente (ka wie lang die sind: sind die nicht evt zuuu lang für die elektrophorese, entstehen nicht aufgrund dieser läääängen die schliere? [oder sind die nur zu lang, wenn ich nicht gensonden zur markeirung nehme, sondern "unspezifisch" anfärbe??])
kommt dann noch ein schritt, oder doch sofort die elektrophorese??? |
|
|
Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
|
| Verfasst am: 13. Apr 2012 20:34 Titel: |
|
|
Die Schlieren entstehen, wenn ich jörg richtig verstanden habe durch die Masse von DNA.
Du hast ja in der Probe nicht nur dein Fragment. Wenn du jetzt den Kram verdaust und dein Gel laufen lässt, hast du massig Banden unterschiedlicher Länge. Normalerweise nimmst du zur Auswertung von Gelelektrophoresen Ethidiumbromid das jede DNA färbt. Wenn du das machst wäre indem Falle aber die ganze Bahn weiß und du hast nix gewonnen.
Deswegen backst du das ganze auf die Membran und färbst mit deinen Sonden nur die Fragmente die dich interessieren.
Die oben genannte Methode funktioniert im Labor z.b. nach Restriktionsverdau von Plasmiden oder PCR, wenn du nicht die ganze genomische DNA da drin hast.
Ethidiumbromid dient prinzipell nur dem Nachweiß: Da ist DNA.
_________________
It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
|
|
a.M
Anmeldungsdatum: 19.09.2011
Beiträge: 38
|
| Verfasst am: 13. Apr 2012 20:45 Titel: |
|
|
.. aber bei PCR vervielfältige ich doch nur genetische Marker (also VNTR oder STR).. dann habe ich doch kurze fragmente, die ich dann mit agarose-gelelektrophorese auftrenne und die werden dann entweder mit ethidiumbromid oder Azur-b-chlorid gefärbt
wenn ich nur repititive dna habe brauch man auch nicht die restriktionsenzyme, weil die ihre palindrome brauchen und in wiederholten basensequenzem entweder immer wieder geschnitten würde oder gar nicht (deshalb sagen einige quellen, dass man die restriktionsenzyme nach der pcr nicht mehr braucht)
.. das mit den schlieren übergeht man also indem man die sonden nimmt!? |
|
|
Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
|
| Verfasst am: 13. Apr 2012 20:57 Titel: |
|
|
Ich dachte bezogen auf den Fall das du genug DNA für die RFLP hast und deswegen ohne PCR den Restriktionsverdau durchführst.
Wenn du dann auf deine Masse von genomischer DNA (immerhin 46 Chromosomen) deine Restriktionsenzyme loslässt, werden die ganz viele Schnittstellen finden und dir die DNA zerhackstückeln.
Wenn du das unspezifisch färbst, erkennst du keine Banden sondern einen dicken fetten Schmier. Deswegen suchst du dann mit markierten Sonden nach deinen Markern auf der Blotmembran.
Wenn du PCR machst hast du deine gesuchten Marker im Überschuss. Da kannst du dann mit Ethidiumbromidfärben und erhälst dann pro Marker eine oder zwei fette Banden (je nachdem ob der Träger homo- oder hetereozygot ist). Da kannst du das ganze direkt auf dem Gel anfärben.
Nur Agarosegele eignen sich nicht besonders gut für die Hybridisierung. Da sind Blottingmembranen für notwendig.
Ich glaub die Restriktionsenzyme dienen nach der PCR dem zweck die Primer wieder loszuwerden, damit die Höhe der Bande auch wirklich nur der Länge des Fragmentes entspricht. Nach der PCR würde sonst erst mal (Fragment+ Primer )vorliegen. Durch den Verdau ist dann nur wieder das Fragment da. Vielleicht könntest du dir die sparen, müssterst dann aber für die Länge immer minus der Länge des Primers rechnen. Wenn dann noch unterschiedliche Labore unterschiedlich lange Primer verwenden, könnte es zur Verwirrung kommen.
Das Bromphenolblau (oder andere Farbstoffe) lässt du mit Laufen um die Lauffront der Proben zu sehen. Das ist wichtig, damit du rechtzeitig die Gelelektrophorese beendest, bevor dir die DNA aus dem Gel läuft.
_________________
It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
|
|
jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
|
| Verfasst am: 14. Apr 2012 09:19 Titel: |
|
|
| a.M hat Folgendes geschrieben: | | wenn ich nur repititive dna habe brauch man auch nicht die restriktionsenzyme, weil die ihre palindrome brauchen und in wiederholten basensequenzem entweder immer wieder geschnitten würde oder gar nicht (deshalb sagen einige quellen, dass man die restriktionsenzyme nach der pcr nicht mehr braucht |
Wenn die Primer standardisiert sind, ist das richtig, dann brauchst du das nicht mehr schneiden. Wichtig ist, dass du alle Proben gleich behandelst, um die Fragmentlänge beurteilen zu können. Liegen die Primer z.B. jeweils 100 Nukleotide stromaufwärts bzw. stromabwärts der repetitiven Sequenz, so erhälst du die repetitive Sequenz plus 200 Nukleotide. Liegen nun die entsprechenden Restriktionsschnittstellen aber jeweils nur 50 Nukleotide von der Wiederholungssequenz entfernt, so erhälst du nach Schneiden die repetitive Sequenz plus 100 Nukleotide. Das musst du berücksichtigen.
| Firelion hat Folgendes geschrieben: |
Ich glaub die Restriktionsenzyme dienen nach der PCR dem zweck die Primer wieder loszuwerden, damit die Höhe der Bande auch wirklich nur der Länge des Fragmentes entspricht. Nach der PCR würde sonst erst mal (Fragment+ Primer )vorliegen. Durch den Verdau ist dann nur wieder das Fragment da. |
Früher haben auch verschiedene Institute verschiedene, in ihren Händen validierte Primer genommen. Die Zeiten gehen zwar langsam zu Ende, doch für einen kommerziell standardisierten Primer muss die Umgebungssequenz der repeats gut charakterisiert sein, was nicht immer der Fall ist. Zudem kann man durch eine Restriktionsanalyse schauen, ob man tatsächlich das gewünschte Fragment vervielfältigt oder ob der Primer unspezifisch irgendwo gebunden hat ohne gleich sequenzieren zu müssen. Wenn es nicht schneidet musst du, einmal angenommen, du willst erstmalig einen Primer testen, eine Sequenzierung durchführen, um nachzuweisen, dass tatsächlich das gewünschte Fragment entstanden ist, weil du ja auch eine Punktmutation in der Schnittstelle ausschliessen musst.
Womöglich könnte das die Verbindung zur Kettenabbruchmethode sein.
_________________
RNA?- just another nucleic acid? |
|
|
a.M
Anmeldungsdatum: 19.09.2011
Beiträge: 38
|
| Verfasst am: 14. Apr 2012 09:24 Titel: vielen Dank! |
|
|
guten morgen!
ich glaube ich habs jetzt! 
danke für eure Bemühungen!
LG
a.M |
|
|
|
|
Registrieren
Login
FAQ
Suchen
