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Nicknick88
Anmeldungsdatum: 03.07.2013
Beiträge: 3
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 Verfasst am: 03. Jul 2013 13:08 Titel: Nachweis von AcH Rezeptor bei Sepsis |
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Meine Frage:
Hallo! Ich muss mich mit dem Nachweis von bestimmten AcH Rezeptoruntereinheiten auseinander setzen. Und zwar im Western Blot, als aufbereitete Muskelprobe. Der Hitergrud ist, das diese Proben eine Sepsis haben und man schauen möchte, ob die Rezeptoren betroffen sind oder nicht.
Meine Ideen:
Ich verwende AcH fetal/ aduld Antikörper von Abcam/ Santa Cruze, aber es lässt sich keine konkrete Bande nachweisen. Auch nicht bei der Positivkontrolle. Kann mir jmd. ein Tipp geben wie ich weiter vorgehen sollte, oder lässt sich das auf der Molekularebene gar nicht nachweisen?
Gruß Lisa |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 04. Jul 2013 13:02 Titel: |
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| Nicknick88 hat Folgendes geschrieben: | | Der Hitergrud ist, das diese Proben eine Sepsis haben und man schauen möchte |
Die Proben haben eine Sepsis? Wie soll das denn gehen?
| Nicknick88 hat Folgendes geschrieben: | | Ich verwende AcH fetal/ aduld Antikörper von Abcam/ Santa Cruze |
Die Antikörper von Santa Cruze sind oftmals nicht zu gebrauchen.
Was für Epitope erkennen die Antikörper (kontinuierliche oder diskontinuierliche)? Für einen Immunoblot solltest du stets Antikörper verwenden, die ein kontinuierliches Epitop erkennen.
Ansonsten: Wie ist das Gewebe gewonnen, aufbereitet und in was für einem Puffer lysiert? Welches Detergenz hast du verwendet?
Wenn du auch in der positiv-Kontrolle nichts siehst, liegt es nahe, dass du das entsprechende Protein während der Präparation "verloren" hast oder aber die Detektion irgendwie nicht funktioniert hat (hier wieder die Frage nach der Art des Epitopes).
Wie hast du detektiert? Mittels sekundärem Antikörper oder über direkte Markierung des primären Antikörpers?
Du solltest eine systematische Fehleranalyse vornehmen, indem du schrittweise die in Frage kommenden Parameter veränderst.
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RNA?- just another nucleic acid? |
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Nicknick88
Anmeldungsdatum: 03.07.2013
Beiträge: 3
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| Verfasst am: 04. Jul 2013 15:00 Titel: |
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Hallo! Danke für eine Antwort. Und zwar haben nicht die Proben direkt eine Sepsis sondern es sind Zwerchfelle aus Versuchstieren, die eine Sepsis induziert bekommen haben  Zu deiner Frage, ob es sich um ein kontinuierliches Epitop handelt. Es ist nichts außergewöhnliches, es handelt sich um den nikotinischen Acetylcholin Rezeptor, allerdings interessiert mich nur der fetale und adulte Teil (γ und ε) und dieser Rezeptor lässt sich eig. in jedem beliebigen Muskel nachweisen...
Zu der gewinnung: >Zwerchfell mit Grinding Kitz aufbereitet mit RiPa Buffer+ Proteasen+ PMSF+Complete, Photometrische Bestimmung der Proteine, fertig! Es handelt sich ja nicht um eine Zellkulturprobe.
Die Detektion verlief über ein Sekundärantikörper, nicht besonderes.
Wenn du auch in der positiv-Kontrolle nichts siehst, liegt es nahe, dass du das entsprechende Protein während der Präparation "verloren" hast
Wie kann man den so was verlieren?
Und vll liegt es an der Glykosylierung? Und wie weise ich das nach?
Danke!
Gruß Lisa |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 04. Jul 2013 18:38 Titel: |
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| Nicknick88 hat Folgendes geschrieben: | | Zu deiner Frage, ob es sich um ein kontinuierliches Epitop handelt. Es ist nichts außergewöhnliches, es handelt sich um den nikotinischen Acetylcholin Rezeptor, allerdings interessiert mich nur der fetale und adulte Teil (γ und ε) und dieser Rezeptor lässt sich eig. in jedem beliebigen Muskel nachweisen... |
Ich meine das Epitop, das von dem Antikörper erkannt wird, also die Aminosäureabfolge, an die der Antikörper bindet. Handelt es sich nämlich um ein diskontinuierliches Epitop, das von dem Antikörper erkannt wird, so kann es sein, dass es nach Denaturierung des Proteinlysates eben nicht mehr erkannt wird, weil die entsprechenden Aminosäuren nicht mehr in räumlicher Nähe zuenander liegen.
| Nicknick88 hat Folgendes geschrieben: | | Zu der gewinnung: >Zwerchfell mit Grinding Kitz aufbereitet mit RiPa Buffer+ Proteasen+ PMSF+Complete, Photometrische Bestimmung der Proteine, fertig! |
Warum die Proteasen? Welche? Wie lange hast du das Lysat mit den Proteasen bei welcher Temparatur inkubiert? Hast du ausser PMSF keine weiteren Proteaseinhibitoren dazugegeben?
Hast du, bevor du das Gel geladen hast, noch einen Mercaptoethanol- und SDS-haltigen Puffer hinzugegeben?
Ich würde hier vermuten, dass es sein könnte, dass das Protein verdaut wurde. Du hast Proteasen hinzugegeben und nur einen Proteaseinhibitor. Damit hast du eine Menge aktiver, wirksamer Proteasen in deinem Lysat. Ist aber nur eine Vermutung. Da würde ich es erst Mal mit anderen, zusätzlichen Proteaseinhibitoren versuchen, um eine grössere Bandbreite an Proteasen damit abzudeken.
Kannst du die Proteasen weglassen? Welchen Zweck sollen die überhaupt haben?
| Nicknick88 hat Folgendes geschrieben: | | Und vll liegt es an der Glykosylierung? Und wie weise ich das nach? |
Entweder durch Verdau der Kohlenhydrate oder mittels eines Antikörpers, der die glykosylierte Form erkennt (Kommt darauf an, was du zeigen möchtest). Musst du schauen, ob es da einen kommerziellen gibt.
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Nicknick88
Anmeldungsdatum: 03.07.2013
Beiträge: 3
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| Verfasst am: 04. Jul 2013 19:44 Titel: |
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Ah ok! Dann wird mir jetzt so einiges klar. Die Peptidase wird dafür verwendet um das Gewebestück besser ,,zu verdauen´´ weil ich mit dem Grinding Kit allein nicht viel erreichen würde. Das Lysat ist mit SDS und ich arbeite auf Eis, damit die Protease nicht zu viel verdaut, oder inaktiv bleibt. Bis jetzt hat es wunderbar bei anderem Gewebe funktioniert. Ich habe ebenfalls ein Laemmli Puffer zum Schluss dazugegeben und auf 70°C 10 min lang erhitzt. Außer PMSF sind keine Proteaseinhibitoren mehr drin, welche sollte ich noch her nehmen?
Vorhin habe ich mir mein Blot noch mal angeschaut und festgestellt das dort eine Bande ist, aber sehr sehr schwach sichtbar, auf der passenden Höhe. Allerdings sind unten viele schöne Banden, die ich aber nicht benötige!  Könnte es auch daran liegen, das es einfach zu wenig Probenmaterial vom Molekulargewicht her ist? |
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