Sonden für RFLP-Analyse

Marie785 · Gast

Meine Frage:
Ich habe eine Frage bezüglich der Herstellung von DNA-Sonden für eine RFLP-Analyse. Hierfür werden ja DNA-Proben von zwei Individuen mit demselben Restriktionsenzym geschnitten, die entstehenden DNA-Fragmente mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend im Rahmen eines Southern-Blots auf eine Nylon- oder Nitrocellulosemembran übertragen. Der nächste Schritt wäre dann ja die Inkubation mit DNA-Sonden, um bestimmte DNA-Fragmente sichtbar machen zu können, wobei bei Vorhandensein einer Restriktionsschnittstelle im entsprechenden genetischen Bereich mehrere kürzere Fragmente vorliegen und bei Wegfall der Schnittstelle wenigere längere. Meine Frage bezieht sich jetzt darauf, wie diese DNA-Sonden zu wählen sind (Länge, Sequenz, Ort), damit das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein von Restriktionsschnittstellen ermittelt werden kann und gezeigt werden kann, dass die DNA-Proben von unterschiedlichen oder mit großer Wahrscheinlichkeit von der gleichen Person stammen.

Meine Ideen:
Ich hätte gesagt, dass man - bei Kenntnis der Sequenz der menschlichen chromosomalen DNA - komplementäre Sonden herstellt, die mehrere unterschiedliche Bereiche des Genoms abdecken, die jeweils Schnittstellen für das verwendete Restriktionsenzym enthalten. Wenn der genomische Bereich bei einem Individuum 3 Schnittstellen, beim anderen jedoch nur 2 Schnittstellen enthält, sieht man später bei dem ersten Individuum 4 und beim zweiten 3 DNA-Fragmente, an die die Sonde komplementär gebunden hat. Stellt man nun komplementäre Sonden zu ausreichend vielen solcher genomischen Bereiche her, kann man eine Person mit hoher Wahrscheinlichkeit identifizieren. Kann mir jemand sagen, ob hier tatsächlich so oder anders vorgegangen werden muss?

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Im Prinzip hast du recht, man schaut sich ein Set aus verschiedenen Genen an.
Bei der Sondenherstellung muss man sich einfach klar machen, dass die Sonden auch mit der DNA auf der Nitrocellulosemembran hybridisieren, wenn es einige Mismatches gibt. Zudem entstehen bei der Sondenherstellung verschieden lange Fragmente eines Gens, da man zufällige Oligonukleotide als Primer einsetzt.