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Elektrodenwiderstand und Mld
 
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Samira80



Anmeldungsdatum: 03.08.2005
Beiträge: 8

BeitragVerfasst am: 03. Aug 2005 13:09    Titel: Elektrodenwiderstand und Mld Antworten mit Zitat

Hallo zusammen smile

Ich bin neu hier und habe gleich eine Frage.

In meiner Diplomarbeit patche ich Zellen im Mld an (whole-cell-patch).
Erste Frage: hat jemand Erfahrung mit diesem Kern?
Zweite Frage: Kann ich auch noch mit Küken patchen, die P4 sind? (Meiner Meinung nach nicht, denn ich verzweifel gerade böse !!)
Dritte Frage: Wie kann ich den Widerstand einer Elektrode erhöhen? Ich habe schon versucht die Hitze mit der Gezogen wird am Puller zu erhöhen, jedoch war das nicht erfolgreich. Ich habe auch die Zeit variiert, mit der gezogen wird. Gibt es noch eine Möglichkeit?

Ich brauche dringend eure Hilfe, denn ich bin im Moment am Verzweifeln traurig

Lieben Gruß
Samira
Noctu
Organisator


Anmeldungsdatum: 04.02.2005
Beiträge: 1429
Wohnort: Rheinland-Pfalz

BeitragVerfasst am: 03. Aug 2005 16:13    Titel: Antworten mit Zitat

hilf mir mal auf die Sprünge, was ist Mld ?
zu 2.: Was ist die Fragestellung in Deinem Experiment ? patchst Du in vivo oder Zellkulturen ?
zu 3: sind die Elektroden innen silanisiert worden ? Welcher Eektrolyt und welche Konz. ist innen ?
Gruß
N.
Samira80



Anmeldungsdatum: 03.08.2005
Beiträge: 8

BeitragVerfasst am: 05. Aug 2005 12:16    Titel: Antworten mit Zitat

Hallo,
also Mld ist der Nucleus mesencephalicus lateralis pars dorsalis. Er befindet sich im Mittelhirn unterhalb des Tectums bei Vögeln. Er ist dem Inferior Colliculus der Säuger homolog.

Ich patche an Slices des Mittelhirns und zwar in diesem Kern.

Die Elektroden werden aus Glaskapillaren gezogen, sie sind nicht silanisiert.

Die Elektrolytlösung ist dem inneren einer Nervenzelle "ähnlich". Sowohl die Zusammensetzung als auch der ph-Wert.

Gruß

Samira

P.S. Der Elektrodenwiderstand stimmt immer noch nicht. Gestern habe ich alles neu angesetzt: Die Patchlösungen, der Schneidpuffer, der Ringer..., einfach nur, um eventuelle Fehler in der Salzkontentration auszuschließen. Außerdem ist das Küken heute E29 (also zwei Tage vor dem Schlupf und dementsprechend sind die Zellen schön) und trotzdem klappt es nicht!

Hilfe traurig
Noctu
Organisator


Anmeldungsdatum: 04.02.2005
Beiträge: 1429
Wohnort: Rheinland-Pfalz

BeitragVerfasst am: 05. Aug 2005 13:19    Titel: Antworten mit Zitat

hast Du die Elektrode die in den Elektrolyt ragt, mal mit AgCl anelektrolysiert ? Hat die Kapillare im inneren nochmal eine kleine Kapillare am Rand, an dem Winkel zieht sich der Elektrolyt bis runter und schafft ein stabiles Übergangspotential. Versuch auch mal 2M KCl als Elektrolyt, die Öffnung unten sollte so klein sein dass da beim patchen nur unwesentlich ein Austausch stattfindet.
Wie sind die Gewebsscheiben geschnitten ? Hört sich nach Vibratom an. Irgendwie ist da ein Artefakt, nimm mal statt Ringer , BME oder noch besser DMEM, ggf mit HEPES puffern, die Zellen im ZNS sind oft etwas kitzlig wenn Ionen fehlen, Osmolarität oder pH nicht stimmt. Ein geringer Zusatz an FCS ( inaktiviert ! ) ist auch noch denkbar . Das Medium auch beim Versuch beibehalten. Versuch auch mal tiefer gelegene Zellen zu patchen, evt. haben die oben einen defekt wg. abgerisener Vortsätze oder so.
Samira80



Anmeldungsdatum: 03.08.2005
Beiträge: 8

BeitragVerfasst am: 05. Aug 2005 13:49    Titel: Antworten mit Zitat

Hallo,

Zitat:
hast Du die Elektrode die in den Elektrolyt ragt, mal mit AgCl anelektrolysiert ? Hat die Kapillare im inneren nochmal eine kleine Kapillare am Rand, an dem Winkel zieht sich der Elektrolyt bis runter und schafft ein stabiles Übergangspotential.


Ja, das mit dem anelektrolysieren habe ich auch gestern gemacht, sowohl mit der Badelektrode, als auch mit der Elektrode in der Glaskapillare. Ich habe sogar den ganzen Elektrodenhalter auseunander genommen und gereinigt...

In der Glaskapillare ist ein Filamient, falls du das meinst grübelnd

Zitat:
Wie sind die Gewebsscheiben geschnitten ? Hört sich nach Vibratom an.


Die Schnitte sind an einem Vibratom horizontal, also senkrecht zur Längsachse des Tectums geschnitten. Die Schnitte sind 400ym dünn.
Und das mit den Zellen in den tiefer gelegenen Schichten habe ich auch schon versucht, und versuche es immer noch.

Zitat:
Irgendwie ist da ein Artefakt, nimm mal statt Ringer , BME oder noch besser DMEM, ggf mit HEPES puffern, die Zellen im ZNS sind oft etwas kitzlig wenn Ionen fehlen, Osmolarität oder pH nicht stimmt. Ein geringer Zusatz an FCS ( inaktiviert ! ) ist auch noch denkbar


Die Patchlösung ist genau auf das innere abgestimmt: HEPES, D-Gluconsäure, MgCl2, EGTA, KCl, CaCl2 und MgATP, ph bei 7,25 oder 7,3.

Der Krebsringer enthält ebenfalls alle wichtigen Ionen und wird angesäuert durch Co2 Begasung.

Der Schneidepuffer enthält kein Calcium, um beim Schneiden das Gewebe nicht zu sher zu stressen.

Diese Methode hat bis jetzt immer geklappt: Ich habe ein Forschungsblock mit Erfolg im Whole-cell-patch gemacht und nun arbeite ich schon seit 3Monaten in diesem Bereich und seit letzte Woche stimmt nichts mehr?! geschockt

Also ich denke echt, dass etwas mit dem Puller nicht mehr stimmt, jedoch habe ich schon versucht Hitze usw zu variieren, jedoch sind die elektroden immer bei 2Mohm Widerstand.

Es ist zum verrückt werden.

Samira
Noctu
Organisator


Anmeldungsdatum: 04.02.2005
Beiträge: 1429
Wohnort: Rheinland-Pfalz

BeitragVerfasst am: 05. Aug 2005 14:17    Titel: Antworten mit Zitat

also dann bin ich mit meinem Latein auch am Ende.
Denkbar ist noch dass doch in der Elektrode ganz unten eine Luftblase ist,
leg mal eine fertige unters Mikroskop und schau mal die Spitze an, mit einer kleinen Heizwendel die in die Nähe kommt kann man die dann austreiben, unter Mikroskop Kontrolle. Oder tauch mal in eine schwache SDS oder Tween Lösung und dann abspülen, vielleicht hilfts durch Benetzung. Nimm ggf. mal eine andere Charge Kapillaren.
Samira80



Anmeldungsdatum: 03.08.2005
Beiträge: 8

BeitragVerfasst am: 05. Aug 2005 15:05    Titel: Antworten mit Zitat

Ich bin soooooooo sauer!!

Jetzt hab ich mal eine Zelle darn und konnte sie auch super anleiten, da hat eine Doktorantin, die auch patcht eine Patchlösung ohne Biocytin hergestellt!!!!!!!

Ich könnt verrückt werden LOL Hammer

Biocytin weise ich später durch einen DAB-Nachweis nach und kann so die abgeleitete Zelle bestimmen (Lage) und auch erkennen, wohin sie projiziert.

Und nun hat sie kein Biocytin rein getan, weil es ja so teuer ist. Aber dafür haben wir es doch gekauft!!

Ich krieg echt die Krise.

Samira
Noctu
Organisator


Anmeldungsdatum: 04.02.2005
Beiträge: 1429
Wohnort: Rheinland-Pfalz

BeitragVerfasst am: 05. Aug 2005 22:56    Titel: Antworten mit Zitat

hast Du es schon mal mit Luciferyellow probiert, ionophoretisch, unter dem Fluoreszenzmikroskop kanns Du dann auch sehen wo die Zelle sitzt, der Farbstoff geht aber auch über Gap-Junctions rüber.
Gast






BeitragVerfasst am: 09. Aug 2005 12:29    Titel: Antworten mit Zitat

Hy samira,

nun, das Problem mit dem Widerstand hatte ich auch einmal und es lag tatsächlich am Puller. Eines der beiden Potentiometer, welches ich immer veränderte war defekt. Ich bemerkte es , als ich am zweiten Änderungen vornahm, denn dadurch zeigt sich eine Änderung im Widerstand. Ein zweites kann auch der Heizdraht sein.

viele Grüße

Andi
Samira80



Anmeldungsdatum: 03.08.2005
Beiträge: 8

BeitragVerfasst am: 09. Aug 2005 14:08    Titel: Antworten mit Zitat

Hallo alle zusammen,

ich habe gute NAchrichten.

Gestern habe ich das Filament austauschen lassen, denn egal wie ich die Hitze hochgetrieben habe oder die Polierzeit verändert habe, die Elktroden waren vorne riesig und nicht poliert.

Naja, jedenfalls, nach dem Austauschen vom Filament, hatte ich innerhalb von 3 Stunden 5 wunderschöne Zellen dran und konnte sie herrlich ableiten und mit Biocytin füllen!

Rock

Das war ein super Tag gestern.

Ich benutze Biocytin, weil es nach dem DAB-Nachweis ewig zu sehen ist, Fluoreszenz plasst ja mit der Zeit aus und ich muß ja die Zellen auch rekonstruieren und das benötigt viel Licht, da viel Zeit.

Ander hier am Institut arbeit mit Luciferyellow, aber wie gesagt, für mich ist Biocytin besser. Außerdem erkennt man jede kleinste Abzweigung ganz genau, das sieht echt toll aus.

Gruß

Samira
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