DNA-Sequenzierung7Elektrophorese dringende Verständnisfragen

estrella · Anmeldungsdatum: 24.10.2004 Beiträge: 17

1. Kommt in jeden der vier Ansätze DNA aus allen möglichen Zellen eines Menschen oder wird ein DNA-Stück aus einer Zelle eines Menschen vorher "geschnitten" und in jeden Ansatz ein anderes Teil gebracht?
Wie ist es möglich, dass in einem Ansatz mehrere Stränge synthetisiert werden, wenn doch nach einem Abbruchnukleotid die Synthese beendet wird?

2. Warum ist die danach bei der Gel-Elektrophorese die abgelesene Banden-Sequenz der zu analysierenden Komplementär? Die Wanderung im elektrischen Feld kommt durch die Länge der Fragemente (was an den Abbruchnukleotiden liegt) zustande und die Abbruchnukleotide wurden ZUFÄLLIG eingebaut. Wieso ist dann die abgelesene Sequenz komplementär wenn das doch alles zufällig war?

Ich bitte um Antwort, in 2 Wochen schreib ich Bio-Abi

WissenXtreme · Anmeldungsdatum: 10.10.2004 Beiträge: 69

hi!
Schreibe auch bald mein Abitur in Biologie.
Die Gelelektrophorese habe ich sehr gut verstanden.
Welche Situation liegt den genau vor, d.h. was wird genau untersucht?
Es ist ja nicht immer so, dass nur bestimmte DNA Stücke genommen werden.
Wenn man die Plasmide von E.coli z.B. dadurch schickt, dann kann man anhand der ersten Bande vergleichen, ob man z.B. richtig geschnitten hat und, ob das DNA-Teilstück richtig eingebaut wurde.

Wie du siehst ist die Situation von der du ausgehst sehr wichtig. Soll die DNA verändert werden oder nicht?

Ich denke es kann die DNA aus jeder Zelle genommen werden, denn bedenke, dass die Zellen ja die gleichen Erbinformationen enthalten!

arabidopsis · Anmeldungsdatum: 21.04.2005 Beiträge: 37

Hallo estrella,

zu 1.:
Für jeden der vier Ansätze wird das gleiche Template (Vorlage) benutzt. Der Unterschied besteht in der Verwendung verschiedener
ddNTP's. Das bedeutet, daß der Abbruch der Elongation in der vorhergegangenen PCR durch Zugabe von ddATP, ddGTP, ddTTP und ddCTP verursacht wurde (jeweils eines pro Ansatz = 4). Die ddNTP's werden jeweils in weitaus geringerer Menge dem PCR-Ansatz zugefügt, als der komplette Satz an dNTP's.
Durch das Durchlaufen einiger PCR-Zyklen werden soviele Transkripte erstellt, daß jedes dNTP der Matrize beim Elongationsabbruch berücksichtigt wird.

zu 2.:
Die Sequenz ist nicht unbedingt komplementär zu der zu analysierenden. Es kommt auf die Wahl des PCR-Primers an. Wenn Du die Sequenz vom 5' zum 3' Ende sequenzierst, erhälst Du die komplementäre Sequenz. Die Analyse vom 3' Ende ausgehend zielt mit dem Primer auf den komplementären Strang. Die PCR-Produkte entsprechen der zu bestimmenden Sequenz.

Anmerkung: Heutzutage sind keine vier "Ansätze" mehr nötig. Man benutzt statt dessen verschiedene Fluoreszenzmarkierungen der ddNTP's in "einem" Ansatz.

Viel Erfolg!

@WissenXtreme:
"Ich denke es kann die DNA aus jeder Zelle genommen werden, denn bedenke, dass die Zellen ja die gleichen Erbinformationen enthalten!"

Das ist leider falsch!
Bedenke: Ohne Mutation keine Evolution!

WissenXtreme · Anmeldungsdatum: 10.10.2004 Beiträge: 69

HI arabidopsis.
Dem stimme ich zu! Mutationen werden ja benörigt, aber grundsätzlich unterscheidet sich die DNA in den Zellen ja nicht wesentlich abgesehen von Mutationen oder?

Wenn man aber eine komplette DNA mit Hilfe der Gelelektrophorese untersuchen möchte, dann muss ich doch mehrere DNAs erstellen.....Mir fällt gerade ein: Man kann ja auch eine DNA nehmen und die verfielfälltigen, wodurch sich das Problem gelöst hätte;)