FACS

I need help · Gast

Hallo!!!

Kann mir jemand sagen wie man FACS Analysen auswertet???Oder zu mindest eine gute Seite im Internet welche solch eine Auswertung beschreibt??? Wir haben CD4 und CD8 Zellen markiert und diese anschließend mittels eines FACS sortiert!! Jetzt hab ich hier einen Dotblot vorliegen, und hab keine Ahnung wie es weiter geht??? traurig

Danke schonmal für eure hilfe!!!

Noctu

CD4 / CD8 sind T-Zellen also Lymphozyten. Zuerst musst Du wissen mit welchen Farbstoff die Antikörper markiert sind, z.B. CD4-FITC , CD8-PE oder umgekehrt. FITC = Fluorescin kommt auf FL1 gelb , PE = Phycoerithirin kommt auf FL2 rot. CD4 sind die T-Helfer, CD8 die T-Suppressor Zellen. Nicht gefärbte T-Zellen sind hier dann NK-Zellen ( die wären CD16 u/o CD56 positiv )

Wie habt Ihr das Blut aufbereitet ? Buffycoat, Vollblut und Ammoniumlyse, Ficoll-Gradient, oder Vollblut und Lyse von Becton Dickinson ?

Prinzipiell brauchst Du zuerst ein FCS/SSC Plot ( Bild 1 ), dann ein Live-Gate um die Lymphos. Im Histogramm FL1 bzw. FL2 dann ein Gate ( R ... ) auf die Fluoreszenz-positiven Zellen setzen ( Bild 2 u. 3 ), die % rechnet dann das Gerät aus.
Oder ( Bild 4 ) ein Dot-Plot FL1/FL2 Quadranten setzten, geht analog.

Gast

Danke das hat mir schonmal sehr geholfen!!! Thumbs up!

Wir haben die Zellen mit FITC und PE gefärbt!! Allerdings sind in meinem Dot-Plot nur rote Punkte zu sehen!! grübelnd

Also wir haben das Blut mit einem Ficoll gradienten aufbereitet! In wie fern beeinflusst denn die Art und Weise das Blut auf zu bereiten später das Ergebnis??

Also möchte ich hiermit im Endeffekt nur den Prozentsatz meiner CD4 and CD8 Zellen bestimmen oder??? Ich muss also nur wissen welche Zellen wo auf dem plot zu finden sind, diese dann den Prozenten zuordnen und das dann anschließend mit der Literatur vergleichen oder???
Und das gleiche gilt dann auch für Histogramme bei denen ja nur 1 Cell typ ermittelt wird oder???

Gast

und in einer zweiten aufgabe haben wir die Zellen mit NAC behandelt!!! Das soll irgendeinen Einfluss auf die CD21 zellen haben???!!! grübelnd

Was hat es denn damit auf sich???

Noctu

mit einer Ficoll Aufreinigung werden die Erys und Granulos abgrtrennt. Auf der Interphase bleiben nur Mnozyten und Lymphos liegen also mononukleäre Zellen. Im FSC/SSC Plot fehlt dann logischerweise die Granulozyten-Wolke. Ficoll ist etwas schonender für die Zellen und die stellen sich dann auch im Plot etwa anders ( schöner ) da, ist aber nicht gravierend.
Daß Dein Plot nur rote Punkte zeigt, liegt an der Art der Einstellung des Gerätes, kann man ändern....
Oben hab ich noch vergessen dass bei den ungefärbten Lymphos noch die B-Zellen sind. Die sind dann CD21 pos. , Ein paar T-Zellen sind auch CD21 pos. hat was mit deren Aktivierung zu tun, es handelt sich dabei um den Komplementrezeptor II.
Wie Du gesagt hast ist der FACS dazu da % einer Zellpopulation zu ermitteln, die Histogramme stellen nur eine Population dar. Der Gag ist der, dass man in wenigen Sekunden tausende Zellen untersuchen kann und statistisch aussagekräftig auswertet.

Kannst Du nochmal nachsehen was NAC ist, sagt mir nix ...

Gast

Also NAC steht für N-acetyl-cyteine! Es ist ein reduzierendes Medikament.

Ich weiss das es dazu dient die Zellen wohl irgendwie proteolytisch zu spalten (shedding). Ich weiss auch das die Zellen davon kapputt gehen und man dies dann später im Histogramm erkennen kann. Es spalltet wohl irgendwie SH-gruppen, bin mir aber nicht sicher. Würde gern den genauen Mechanismus verstehen...

Noctu

Ich kenne NAC nur als Schleimlöser, dass die Bildung von Disulfidbrüchen verhindert und dann der Schleim nicht viskos werden kann...
Beim FACS ist mir das völlig unbekannt, sorry....

Eine Idee noch, hattet Ihr ggf. mit PI ( Propidiumiodid ) Kerne gegengefärbt, Annexin V gefärbt oder Caspasen-Aktivität bestimmt in dem Kontext ?

Wenn die Info essentiell ist, kann ich noch einen Fachmann auf dem Gebiet ansprechen, wenn ich ihn erreiche kann ich mich bis Freitag schlau machen.

Gast

Nein, das haben wir nicht gemacht!!!

Aber danke trotzdem für deine Hilfe, hat mir echt alles sehr weiter geholfen!!!