Somatostatinsynthese

maryam · Anmeldungsdatum: 22.12.2010 Beiträge: 25

Meine Frage:
Guten Abend!

Ich habe eine kurze Frage zur Synthese von Somatostatin. Man benutzt dazu die Gentechnik, indem man den DNA abschnitt, der für Somatostatin codiert in ein Plasmid einbaut und diesen dann in ein Bakterium bringt woraufhin das Bakterium Somatostatin produziert. Ich habe im Linder die Info gefunden, dass Somatostatingen nach dem ersten Strukturgen in ein lac-operon eingebaut wird. Folglich lässt sich die Synthese von Somatostatin durch Lactosehinzugabe oder Lactoseentfernen regeln.

Mein Problem ist, dass ich nicht genau verstehe, was geregelt werden soll. Theoretisch müsste doch nur ein mal Lactose hinzugegeben werden, damit die im lac-operon enthaltenen Somatostatingene exprimiert werden, oder?

Meine Ideen:
Da das lac-operon ja durch das einfügen des Somatostatingens für den Lactoseabbau unbrauchbar geworden ist, dürften die Bakterien keine Lactose mehr abbauen, und man bräuchte nur ein einziges Mal Lactose hinzugeben. Es sei denn, das Bakterium besitzt noch andere lac-operons, natürlich. Trotzdem dürfte das einzige Ziel der Regulation der Somotostatinsynthese doch der 'Anstoß' eben jener sein, denn eine Verringerung der Synthese wäre doch sinnlos, oder?

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Prinzipiell richtig, doch meistens wird IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) als Induktor genutzt.
IPTG bindet auch anstelle von Allolactose an den Repressor und inaktiviert diesen.

Der Vorteil von IPTG besteht darin, dass es ohne die Permease in die Zelle gelangen kann und nicht durch die ß- Galaktosidase gespalten wird.

Beachte dazu, dass das lac- operon auch auf dem Bakterienchromosom vorhanden, während das Somatostatingen auf einem Plasmid lokalisiert ist.
Die Synthese der Laktose- verstoffwechselnden Enzyme fällt also nicht vollständig aus, eher werden die Bakterien mit einem zusätzlichen lac- operon transformiert.

Diese beiden operons "konkurrieren" dabei um die Repressor- und Aktivatorbindung.

Dazu sei beachtet, dass die Inhibition des Repressors nicht ausreicht, um eine maximale Expression des lac- operons zu erreichen, auch die Aktivierung des Promoters durch einen Aktivator spielt dabei eine Rolle. Dieser Aktivator wird durch cAMP reguliert, welches wiederum bei Glucosemangel vermehrt anfällt.
So wird gewährleistet, dass das lac- operon nicht stärker induziert wird, als es der Energiestoffwechsel der Zelle "fordert".

Und: Ja, den relevanten Beitrag zur Regulation leistet die Induktion des lac- operons.

maryam · Anmeldungsdatum: 22.12.2010 Beiträge: 25

Dankeschön!

Warum muss überhaupt reguliert werden? Wäre es nicht eigentlich einfacher, das Somatostatingen einfach in den Plasmid einzubauen, ohne lac-operon? Dann müsste man überhaupt keinen Induktor benutzen und hätte nicht soviel Arbeit beim Herstellen der Plasmide.
Oder wird Somatostatin nur unter bestimmten Bedingungen hergestellt, die mit Hilfe des lac-operons irgendwie erschaffen werden?

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Wenn das Zielgen "einfach irgendwo" ins Plasmid kloniert würde, ist nicht sicher, ob es überhaupt exprimiert wird. Denn zur Expression eines Gens wird so oder so eine Einheit benötigt, die die Expression einleitet, also mindestens ein Promoter.
Dazu kämme es darauf an, wo das Gen "landete", landete es z.B. in dem sog. "orign of replication (ORI)" könnte das Plasmid womöglich nicht mehr vervielfältigt werden. Würde es in die Antibiotikaresistenz inseriert, wäre eine sichere Selektion der positiven Klone nicht mehr möglich. Es muss auch gewähleistet sein, dass das Leseraster eingehalten wird.
Also ist ein definierter Inertionsort schon sinnvoll (und technisch auch einfacher).

Unser "Minimalplasmid" hat also im einfachsten Fall drei Bereiche: Einen Promoter, eine Antibiotikaresistenz, einen ORI und eine sog. "multiple- cloning- site" (multiple Klonierungsstelle mit Schnittstellen für verschiedene Restriktionsenzyme; definierter Insertionsort). In letztere wird dann das "Zielgen" kloniert.

Nun gibt es zwei Varianten:

Die erste wäre die Wahl eines konstitutiv aktiven Promoters, also eines Promoters, dessen Aktivität nahezu unabhängig von den Stoffwechselanforderungen ist; der also ein Gen reguliert, das immer benötigt wird. Dabei sei erwähnt, dass es den Idealfall eines solchen Gens eigentlich nicht gibt, denn prinzipiell wird jedes Gen den Anforderungen entsprechend exprimiert. Es existieren jedoch Gene, die in einer "ausgeglichenen" Stoffwechsellage immer in der nahezu gleichen Menge benötigt werden. Würde ein solches Gen gewählt, wäre das maximal zu erreichende Expressionsniveau meistens relativ zu den strenger regulierten Genen gering.
Zum zweiten würde immer Somatostatin synthetisiert werden, egal ob die Bakterien zur Amplifikation ("Vervielfältigung") des Plasmids wachsen sollen oder ob sie Somatostatin synthetisieren sollen.

Die zweite Variante wäre ein induzierbares System (wie z.B. das lac- operon). Der Vorteil ist, dass ich die Amplifikation des Plasmids von der Synthese des gewünschten Proteins zeitlich trennen kann. Ich kann also erst das Plasmid in das Bakterium transformieren, mir dann grosse Mengen dieser Bakterien heranzüchten und diese dann das Somatostatin (oder was auch immer) "herstellen" lassen. So kann ich entscheiden, "wann" die Bakterien sich selbst und damit das Plasmid vervielfältigen oder das Somatostatin "herstellen" sollen.
Zudem können innerhalb relativ kurzer Zeit relativ grosse Mengen des gewünschten Proteins synthetisiert werden.

Bei der Wahl des induzierbaren Systems werden folgende Umstände berücksichtigt:
- es muss sich um ein System handeln, das gut erforscht ist
- es muss sich um ein System handeln, das zuverlässig arbeitet
- es muss sich um ein System handeln, zu dem ein synthetischer Induktor zur Verfügung steht, der im Idealfall von den Genprodukten des induzierten Systems nicht verstoffwechselt wird und nicht auf eine bestimmte Stoffwechsellage angewiesen ist, um z.B. in die Zelle transportiert zu werden
- es muss sich um ein kommerziell verfügbares System handeln, das möglichst kompakt ist und nicht über allzu komplexe Regulationsmechanismen verfügt und bei Aktivierung die Zelle nicht unter allzu grossen Stress setzt (bei Stress weiss man nämlich nie so genau, was die Bakterien so alles mit dem Plasmid anstellen, manchmal "werfen" sie Bereiche "raus", von denen sie keinen Nutzen haben, manchmal inserieren sie irgendwelche Bereiche, es sollte ihnen also gut gehen...).

Alle diese Kriterien erfüllt das lac- operon.

Also wäre es nicht einfacher, das "einfach so" zu machen, denn die einzelnen "Schritte" bei einer Klonierung sind eigentlich immer die gleichen und der Aufwand der "Herstellung" der Plasmide ist i.d.R. nicht von dem inserierten Gen oder dem Ort der Insertion abhängig.

Einen Überblick über die Klonierungstechnik kannst du dir bei Wikipedia verschaffen:

http://de.wikipedia.org/wiki/Klonierung

Ich hoffe, damit alle Klarheiten beseitigt zu haben..... Zwinkern

maryam · Anmeldungsdatum: 22.12.2010 Beiträge: 25

Vielen Dank für deine Mühe! Ich glaube jetzt habe ich es verstanden. Das Bakterium kann also nich gleichzeitig viel wachsen, und viel Somatostatin produzieren? Ich hatte immer gedacht, die produzieren die gentechnischen Medikamente so nebenbei mit. Aber eigentlich ist es logisch, dass sie weniger Energie in die Somatostatinsynthese stecken können, wenn sie mit dem Wachsen und Teilen "beschäftigt" sind.
Vielen Dank nochmal, beeindruckend, was du alles weißt smile

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

So kann man sich das vorstellen, obwohl sich die Somatostatinsynthese und der Wachstum nicht ausschliessen, es ist aber effektiver, wenn die Prozesse hintereinander ablaufen (irgendwer will damit ja auch Geld verdienen...).

Wenige Bakterien synthetisieren wenig Somatostatin, replizierende Bakterien sind während der Replikationsphase nicht so "stoffwechselaktiv", was u.a. die Somatostatinsynthese anbelangt.

Also lässt man die Bakterien sich vermehren, bis die Kultur schön dichtgewachsen ist und gibt dann IPTG hinzu, damit das Somatostatin "hergestellt" wird.

Da Somatostatin zudem kein physiologisches Produkt von e. coli ist und auch nicht sezerniert wird (das Somatostatin ist also in dem Bakterium und kommt da auch nicht raus), "stört" es irgendwann den normalen Zellstoffwechsel.

Elegant wäre natürlich, wenn die Bakterien das Somatostatin sezernierten, es ist aber nach meinem Wissen bisher noch kein gutes System dafür etabliert.

edit: Ich möchte mich zum oben gesagten korrigieren, zur Transformation mit rekombinanten Plasmiden (also auch zur Somatostatin- Synthese) werden lac- negative e. coli- Stämme eingesetzt, das transformierte lac- operon ist damit das einzige in den Bakterien vorhandene.