klonierungstechnik

joey99 · Gast

Meine Frage:
hi!
wie funktioniert die Biobrick-basierende Klonierung?

Meine Ideen:
ich weiß leider überhaupt nicht wie das funktioniert und bücher und internert heben da auch nicht all zu viel her. also ich bin für jede hilfe dankbar!

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Die Klonierung selbst erfolgt wie andere Klonierungen auch:
Fragment erzeugen oder bereits erzeugtes Fragment mit Restriktionsenzymen ausschneiden, aufreinigen und in ein Plasmid ligieren. Dann Bakterien transformoieren und Expressionsanalysen vornehmen (die letzten beiden Punkte gehören eigentlich nicht mehr zur Klonierung).

Kannst ja auch mal dort lesen:

http://www.jbioleng.org/content/pdf/1754-1611-2-5.pdf

joey99 · Gast

also ich hab hier mal bei google ein buch gefunden das genau eine abbildung enthält, die zeigt wie wir das machen müssen:

bei google bücher: Synthetic Biology: Methods for Building and Programming Life
(seite 314)

das problem ist aber das ich das einfach nicht kapiere wieso das so gemacht wird und wie das da überhaupt abläuft. vielleicht kannst du mir das nochmal anhand dieser übersicht erklären?

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Tja, leider kann ich diese Seite in dem "Methods of Enzymology"-Paper nicht einsehen......

joey99 · Gast

aber das buch heißt doch
Synthetic Biology: Methods for Building and Programming Life
und wenn man das bei google bücher eingibt ist es gleich das erste was oben steht und da wird die seite 314 angezeigt mit der abbildung....

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Ich komme dann auf diese Seite

Die Vorschau geht bei mir bis einschliesslich Seite 25.

Wie wäre es, wenn du den link zu der Seite hier postest?
Dazu müsstest du jedoch angemeldet sein.
Ich befürchte aber, wir kommen sonst nicht weiter, es sei denn, du kannst deine Frage(n) präzisieren oder zu einer alternativen Abbildung verlinken.

joey99 · Anmeldungsdatum: 20.11.2011 Beiträge: 7

so ich hab mich jetzt mal angemeldet.
ich hoffe es klappt jetzt
hier ist der link:
http://books.google.de/books?id=EJXBAXJYC1oC&lpg=PA318&ots=6XjMX4SCqU&dq=biobrick%20upstream%20part%20downstream%20part%20destination%20vector&hl=de&pg=PA314#v=onepage&q=biobrick%20upstream%20part%20downstream%20part%20destination%20vector&f=false

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Sorry, ich muss dich enttäuschen, ich kann das wieder nur bis Seite 25 einsehen.....

Grafik kopieren und als Anhang posten?

joey99 · Anmeldungsdatum: 20.11.2011 Beiträge: 7

ich hab jetzt noch ein anderes bild gefunden, wo genau dasselbe dargestellt ist:
http://www.neb.com/nebecomm/productfiles/2704/images/E0546_v1_000003.jpg

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Und was genau ist dir daran nicht klar?
Du schneidest zwei Elemente aus und klonierst sie hintereinander in ein neues Plasmid.

Oder geht es darum, was für einen "Sinn" das hat?
Was sind denn sog. "Biobricks" und was will man damit zeigen?

joey99 · Anmeldungsdatum: 20.11.2011 Beiträge: 7

ich versteh nicht wie das im ersten schritt geschnitten wird und warum dann die fragmente im zweiten schritt übrig bleiben. und wie die dann letztlich zusammengesetzt werden.
ich würd auch gerne wissen was der sinn ist richtig also warum macht man das so? und was biobricks sind und was man damit zeigen will weiß ich auch nicht...

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Wofür brauchst du denn das?

Übersetze doch einmal den Begriff "biobrick" und erzähle, was du dir dann darunter vorstellst.
Wenn die Definition nicht klar ist, brauchen wir mit den Fragen gar nicht weiter machen, denn dann wirst du weiterhin Verständnisprobleme haben.

joey99 · Anmeldungsdatum: 20.11.2011 Beiträge: 7

naja biobrick heißt ja soviel wie baustein. bedeutet dass dann irgendwie dass man sich verschiedene teile von unterschiedlichen plasmiden zusammensucht und diese fusioniert? aber wie soll das gehen?

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Biobricks sind "Bio-Bausteine", also bezüglich Struktur und Funktion definierte DNA-Sequenzen.

Alles begann mit der synthetischen Herstellung von einzelnen Proteinen in E. coli, wie z.B. dem Insulin. Das Insulingen könnte also ein Biobrick sein, weil es gut charakterisiert ist. Nun versucht man, ein standardisiertes Verfahren zu etablieren, in dem verschiedene Bausteine miteinander kombiniert werden können. Das Ziel ist z.B. die herstellung von synthetischen Organismen.
Spinnen wir beispielhaft einmal das Insulin-Beispiel durch:
Ich könnte nun in E.coli nicht nur Insulin selbst herstellen, sondern auch den ganzen Apparat klonieren, der Insulin modifiziert, so dass es ein in E. coli funktionsfähiges Protein wird. Dann noch den Insulinrezeptor dazu, einen Promoter, der auf Glucose in der Umgebung regiert und die insulinabhängigen Glucosetransporter, so dass das Bakterium bezüglich seines Glucosestoffwechsels nun Insulin braucht, das es sich auch selbst herstellt. Es würde hier dann den Weg gehen, den die menschlichen Zellen auch gehen.
Doch wurden dazu Sequenzen benutzt, die nicht ausschliesslich im Menschen vorkommen, wie z.B. der Promoter in unserem Beispiel, weil der Mensch über solch einen rein Glucoseabhängigen Promoter nicht verfügt.

Wenn man das noch weiter spinnt, kann man sich vollständig synthetische Organismen vorstellen.
Doch das ist ein weiter Weg. Also wurde damit begonnen, solche Bausteine erst einmal in standardisierten Vektor-Plasmiden zur Verfügung zu stellen, in denen sie unter Verwendung stets der gleichen Restriktionsenzyme beliebig miteinander kombinierbar sind.
Das sind dann sog. Biobricks.

Du schneidest also zwei Biobricks aus und klonierst sie hintereinander in ein Plasmid. Damit du für das Anfügen z.B. eines dritten Bausteines immer noch die gleichen Restriktionsenzyme benutzen kannst, werden bei der Klonierungstechnik die Schnittstellen zwischen den Bausteinen zerstört. So kannst du dann beliebige Kompositionen aus verschiedenen Bausteinen erzeugen.
Und genau das symbolisiert die von dir angeführte Grafik.

joey99 · Anmeldungsdatum: 20.11.2011 Beiträge: 7

naja so richtig klar ist mir das noch nicht. kann mann denn sagen das biobricks z.B. ein promotor ist oder allgemein ein funktionelles element? und man sucht sich dann sozusagen bestimmte biobricks zusammen, die man eben braucht, und fusioniert sie? aber kann man das denn so einfach machen?
was heißt in der abbildung upstream part, downstream part und destination plasmid? wofür steht das? und wenn da z.B. cuit E+S steht, heißt dass doch dass mit den Restriktionsenzymen E und S geschitten wird richtig? aber wenn mit E und S geschitten wird wieso sind dann in der zweiten abbildung noch die schittstellen vorhanden? müssten die dann nicht weg sein? das gleich dann auch für X+P und E+P? weißt du was ich meine? und wenn ich dann alle drei fragmente zusammenfüge dann sind doch im unteren bild gar nicht mehr alle teil im rekombinanten plasmid, die man in den 3 abbildungen zuvor gesehen hat?

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

joey99 · Anmeldungsdatum: 20.11.2011 Beiträge: 7

aber warum wird beim destination plasmid die kassette rausgeschnitten und nicht in die ander richtung? das wäre doch genauso gut denkbar, weil das ja auch zwischen den schnittstellen liegt. und das mit dem zusammenfügen versteht ich nicht. wie entsteht daraus M? weil vorher waren da noch jeweils s und X?

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

M ist hier eine Sequenz, die entstand, weil Überhänge von verschiedenen Enzymen aneinanderligiert wurden (XbaI und SpeI). M heisst hier "mixed site", die wird dann von keinem der Restriktionsenzyme mehr erkannt, damit man dann mit der gleichen Methode noch weitere Insertionen einfügen könnte.

Wenn du das schneidest, hast du natürlich immer zwei Fragmente, die Frage ist, welches du benutzen möchtest. Die Fragmente werden dann aufgetrennt und aufgereinigt, bevor sie in die Ligation eingesetzt werden.
Und in dem Fall des Vektors möchtest du halt das Plasmidrückrat benutzen und nicht die Reporterkassette. Das andere Fragment entsteht aber auch,da kommt nichts abhanden.
Das Rückrat könnte auch das Gleiche sein, in dem das upstream-Element steckte oder das downstream-Element. Das ist ja gerade das, was dieses standardisierte System ausmacht, die Plasmide sind prinzipiell die gleichen, nur halt mit verschiedenen Insertionen.
Natürlich könntest du auch ein anderes Plasmid nehmen. Aber zumindestdie kommerziell erhältlichen Biobrick-Plasmide sind stets die gleichen und unterscheiden sich nur durch die Baustein-Kassetten selbst.

joey99 · Anmeldungsdatum: 20.11.2011 Beiträge: 7

ok aber worin besteht jetzt genau der sinn davon? einfach nur dass man dadurch verschiedene elemente beliebig kombinieren und dann halt klonieren kann?

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Was heisst "einfach nur"?
Das eröffnet einfache Möglichkeiten, gut untersuchte Sequenzen in belieger Komposition zu untersuchen.
Aber genau, das ist der Sinn hinter dieser Form der Standardisierung.

Wenn du dich mal mit Klonierungen beschäftigt hast und dabei zwei oder mehr Elemente aus verschiedenen Systemen aneinanderklonieren wolltest, dann weisst du, dass das manchmal mehrere Wochen und viiiiiele Versuche dauern kann. Da ist eine Standardisierung eine nützliche und einfache Geschichte, die im "high-throughput-Zeitalter" doch als Innovation zu werten ist.