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Nachricht |
anja25
Gast
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 Verfasst am: 27. Nov 2011 17:08 Titel: gateway-klonierung |
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Meine Frage:
hi! ich brauch eure hilfe bei einer hausaufgabe zur gateway-klonierung.
wie diese funktioniert weiß ich. die aufgabe beid er ich nicht weiter komme ist: ich soll ein fusionprotein in einem expressionsystem exprimieren (alles theoretisch). und dabei erwähnen welches expressionssystem und welchen expressionswirt ich verwenden würde und warum? das prinzip des ausgewählten expressionssystems (was ist denn damit gemeint?). wie die expression durchgeführt wird? und wie ich das fusionsprotein detektieren würde? ich hoffe jemand kann mir dabei helfen denn hier sehich irgendwie gar nicht durch...
Meine Ideen:
danke schon mal |
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cajo
Anmeldungsdatum: 26.10.2008
Beiträge: 162
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| Verfasst am: 27. Nov 2011 23:53 Titel: Re: gateway-klonierung |
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| anja25 hat Folgendes geschrieben: | | ...und dabei erwähnen welches expressionssystem und welchen expressionswirt ich verwenden würde und warum? das prinzip des ausgewählten expressionssystems (was ist denn damit gemeint?) |
Expressionssystem = Expressionswirt
-> Man kann sein Proteine in unterschiedlichen Organismen produzieren lassen... Die gängigsten sind Bakterien, Hefen, Insektenzellen und Säugerzellen. Alle haben ihre Vor- und Nachteile (Proteinausbeute, Proteinfaltungen, Glykoslierungsmuster, Lokalisation der Proteine, Proteingröße,...). Was in deinem Fall am besten ist, kann ich ohne weitere Informationen nicht sagen.
| anja25 hat Folgendes geschrieben: | | und wie ich das fusionsprotein detektieren würde? |
Das funktioniert, indem man ein sogenanntes Reporterprotein an das Protein koppelt. Das kann zum Beispiel eine beta-Galactosidase, Luciferase oder sonst was sein... Am besten baut man noch eine Schnittstelle ein, damit man - bevor man mit dem Protein weiterarbeitet - das Reporterprotein wieder abspalten kann...
vg |
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anja25
Gast
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| Verfasst am: 28. Nov 2011 15:11 Titel: |
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und ich soll ja jetzt noch eine beliebige sequenz in den expressionsvektor klonieren. und dazu soll ich auch darauf eingehen wie ich die entsprechenden primer mit gateway-überhängen für die herstellung des pcr-produkts generiere. wie mach ich das denn? muss ich mir jetzt eine konkrete sequenz aussuchen? was sind denn die gateway-überhänge? etwa attb usw? aber welche sequenz haben denn die genau? |
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anja25
Gast
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| Verfasst am: 28. Nov 2011 22:24 Titel: |
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hate wirklich niemand eine idee? ich würd gerne auch noch wissen welches prinzip das expressionssystem e.coli hat? was ist denn damit gemeint? (also ich soll ´das fusionsprotein exprimieren und dabei darauf eingehen). |
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cajo
Anmeldungsdatum: 26.10.2008
Beiträge: 162
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| Verfasst am: 29. Nov 2011 15:11 Titel: |
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Erstmal noch ein kleiner Nachtrag: Du kannst dein Protein auch ohne den Reportergen-Quatsch detektieren und zwar über SDS-PAGE und Western-Blot (vorausgesetzt du willst nur detektieren und nicht quantifizieren...)
| anja25 hat Folgendes geschrieben: | | und ich soll ja jetzt noch eine beliebige sequenz in den expressionsvektor klonieren. und dazu soll ich auch darauf eingehen wie ich die entsprechenden primer mit gateway-überhängen für die herstellung des pcr-produkts generiere. wie mach ich das denn? muss ich mir jetzt eine konkrete sequenz aussuchen? was sind denn die gateway-überhänge? etwa attb usw? aber welche sequenz haben denn die genau? |
Ich kenne mich ehrlichgesagt mit der Gateway-Klonierung nicht aus (und habe im Moment keine Zeit mich da einzulesen...).
Allgemein müssen die Primer komplementär zur entsprechenden DNA-Sequenz sein. Sie sollten nicht zu kurz sein, damit sie noch spezifisch binden können und auch nicht zu lang, da sonst die Schmelztemperatur zu hoch wird oder die Wahrscheinlichkeit von self-annaeling sites oder Loop-Bildungen erhöht wird...
Wenn dein Lehrer nichts konkretes gesagt hat, dann würde ich mir keine Sequenzen aussuchen sondern alles allgemein halten.
Hoffe das hilft dir alles ein bisschen^^ |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 29. Nov 2011 21:09 Titel: |
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Du brauchst da spezielle Überhänge, damit deine Sequenz von den an der Rekombination beteiligten Enzymen erkannt wird. An der 5'-Seite musst du die Sequenz 5'-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CT-3' anhängen und an dem 3'-Ende die zu folgender Sequenz komplementär-reverse Sequenz: 5'-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3', das sind die sog. attB-Ereknnungsstellen (Für die Primer kannst du die so übernehmen, die erste Sequenz für den In-sense-Primer und die zweite für den Antisense-Primer).
| anja25 hat Folgendes geschrieben: | | hate wirklich niemand eine idee? ich würd gerne auch noch wissen welches prinzip das expressionssystem e.coli hat? |
Was weisst du denn bis jetzt über die gateway-Klonierung?
| anja25 hat Folgendes geschrieben: | | (also ich soll ´das fusionsprotein exprimieren und dabei darauf eingehen). |
Was für ein Fusionsprotein denn?
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RNA?- just another nucleic acid? |
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anja25
Gast
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| Verfasst am: 30. Nov 2011 10:04 Titel: |
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ok die sequenzen hab ich jetzt auch schon gefunden. und muss ich mir jetzt eigentlich noch eine spezielle sequenz, die kodiert wird ausdenken oder nicht? weil ich soll auch auf die pcr eingehen mit temperatur und so. da brauch ich das doch eigentlich oder?
bei der gateway-klonierung gibts ja eine BP- und LR-Reaktion. bei der Bp-reaktion wird die zu klonierende sequenz (durch attB-Sequenzen flankiert) mit dem pDONR-vektor rekombiniert so dass dass ccdB-Gen des vektors gegen die zu klonierende sequenz ausgetauscht wird. das bringt man dann in e.coli rein selektiert auf antibiotikahaltiges medium. aus den zellen die wachsen isoliert man dann das plasmid (jetzt eingangsvektor) und für damit die LR-Reaktion durch. man kreuzt dann eingangsvektor mit richtungsvektor. hierbei wird ccdB-gen des richtungsvektors gegen zu klonierende sequenz ausgetauscht und damit entsteht expressionsvektor und ein nebenprodukt. das alles wird wieder in e.coli eingebracht und selektiert und die zellen die wachsen aus denen isoliert man wieder plasmid. und damit hat man die zu klonierende sequenz kloniert.
und das mit dem fusionsprotein versteh ich ja auch nicht...eigentlich soll ich ja nur eine beliebige sequenz klonieren. oder ist damit die zu klonierende sequenz gemeint? |
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anja25
Gast
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| Verfasst am: 30. Nov 2011 13:12 Titel: |
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noch ein nachtrag: ich glaub das fusionsprotein besteht aus der zu kodierenden sequenz und aus einem Tag. |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 01. Dez 2011 09:46 Titel: |
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| anja25 hat Folgendes geschrieben: | | da brauch ich das doch eigentlich oder? |
Würde ich auch sagen, aber wieso ist die zu klonierende Sequenz unbekannt?
| anja25 hat Folgendes geschrieben: | | und das mit dem fusionsprotein versteh ich ja auch nicht...eigentlich soll ich ja nur eine beliebige sequenz klonieren. oder ist damit die zu klonierende sequenz gemeint? |
Ja, ich denke schon, nur war bis dato wohl unklar, was eigentlich fusioniert werden soll oder nicht?
| anja25 hat Folgendes geschrieben: | | ich glaub das fusionsprotein besteht aus der zu kodierenden sequenz und aus einem Tag. |
Da müsstest du auch präziser werden, willst du hier das myc-tag benutzen oder welches?
Dann müsstest du, abhängig davon, an welcher Seite (3' oder 5') das tag sitzen soll, die entsprechende Sequenz noch in den Primer einbauen.
Dann hättest du auf einer Seite aber ganz schön lange Überhänge, nämlich zum einen die attB-Sequenz und zum anderen das tag.
Das musst du dann bei der Schmelztemperatur der Primer berücksichtigen, da diese in den ersten Zyklen nicht vollständig komplementär zur Zielsequenz sind. Ich würde da eine sogenannte "two-step-PCR" fahren, also die ersten sagen wir einmal 10 Zyklen mit der Annealing-Temperatur der zur Zielsequenz komplementären Sequenz und die folgenden 20-30 Zyklen mit der Annealing-Temperatur der vollständigen Primer.
An einer Seite, nämlich an der, an der das tag hängt, ist der Überhang nämlich grösser als die Sequenz, die komplementär zur Zielsequenz ist.
Dass du allerdings die Zielsequenz nicht kennst, wundert mich....
Sollst du das denn nur theoretisch machen oder sollst du da hinterher auch tatsächlich was klonieren?
Wofür brauchst du das, also was willst du untersuchen?
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RNA?- just another nucleic acid? |
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