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benny89
Gast
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 Verfasst am: 10. Dez 2011 11:35 Titel: proteinexpression |
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Meine Frage:
Hi!
Was sind die VOrteile von einem n-terminalen GST-Tag bezüglich der Proteinexpression?
wäre super wenn mir einer helfen könnte!
Meine Ideen:
danke |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 10. Dez 2011 18:38 Titel: |
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Ich glaube nicht, dass es da Vorteile in dem Expressionsverhalten gibt.
Normalerweise machst du das, um die Proteine für ein geeignetes Nachweisverfahren (hier z.B. Affinitätschromatographie) zu markeiren.
Was willst du denn machen? Einen Pull-down? Willst du Protein-Interaktionen nachweisen?
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RNA?- just another nucleic acid? |
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benny89
Gast
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| Verfasst am: 11. Dez 2011 09:08 Titel: |
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naja ich habe einen destinationvektor, der für einen N-terminalen Tag kodiert. Und da ist dann eben die Frage welche vorteile oder vorzüge dieser Tag hinswichtlich der proteinexpression hat. ich soll dann danach aus dem Destinationvektor einen LIC-kompatiblen Expressionsvektor generieren. (irgendiwe muss da die gatewaykassette gegen die LIC-Kassette austausch via BsrGI-Stellen). könntest du mir vllt auch erklären wie das geht? und gibt es doch irgendwelche vorzüge bei dem tag? |
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PaGe
Moderator
Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3549
Wohnort: Hannover
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| Verfasst am: 11. Dez 2011 10:49 Titel: |
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Wenn du möchtest, dass wir dir helfen, bemühe dich um eine angemessene Rechtschreibung und Grammatik.
Hast du eine Karte der Vektoren mit allen Schnittstellen oder dessen Sequenz?
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Die deutsche Rechtschreibung ist Freeware, du darfst sie kostenlos nutzen. Aber sie ist nicht Open Source, d. h., du darfst sie nicht verändern oder in veränderter Form veröffentlichen. |
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benny89
Gast
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| Verfasst am: 11. Dez 2011 11:35 Titel: |
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sorry...sowas passiert wohl mal beim schreiben...
ich habe die bestandteile des vektors:
T7,RBS, ATG,GST,attR1,Cm-Resistenzgen,ccdB,attR2,T7 Terminator
in dieser Reihenfolge ist es gegeben... |
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PaGe
Moderator
Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3549
Wohnort: Hannover
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| Verfasst am: 11. Dez 2011 13:51 Titel: |
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Es geht nicht um den Aufbau, sondern die Schnittstellen bzw. die DNA-Sequenz.
Jetzt noch die Grammatik beachten 
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Die deutsche Rechtschreibung ist Freeware, du darfst sie kostenlos nutzen. Aber sie ist nicht Open Source, d. h., du darfst sie nicht verändern oder in veränderter Form veröffentlichen. |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 11. Dez 2011 18:47 Titel: |
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Heisst LIC "ligaseunabhängig"?
Ich weiss noch immer nicht genau, was du eigentlich vorhast.
Welcher Vektor ist das denn, also wie heisst er? Wo liegt die multiple cloning site und warum ist dein Resistenzgen von den gateway-sites flankiert?
Sorry, aber das ist für mich zu kryptisch, oder missverstehe ich da etwas?
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RNA?- just another nucleic acid? |
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benny89
Gast
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| Verfasst am: 11. Dez 2011 20:54 Titel: |
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LIC steht für ligation independant cloning. ich weiß auch nicht warum das resistenzgen von den beiden rekombinationsschnittstellen flankiert wird...hab ich mich auch schon gefragt... der vektor ist der pDEST15-vektor. und dieser soll eben zu einem LIC-kompatiblen expressionsvektor generiert werden. |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 11. Dez 2011 22:04 Titel: |
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Hast du dir den Vektor denn schon mal genau angeschaut?
Die chloramphenicol-Resistenz ist nicht essentiell für die Amplifikation, da der Vektor noch über eine Ampicillin-Resistenz verfügt. An dem Chloramphenicolresistenzgen soll hinterher dein "gene of interest" sitzen. Damit ist auch klar, warum die von den gateway-sites flankiert wird.
Schau dir also erst noch einmal den Vektor genau an und auch die Sequenzen, z.B. hier:
http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ecoli_gateway_man.pdf
Dann erkläre doch einmal die Grundlagen der ligaseunabhängigen Klonierung. Welche Matritzen werden in die PCR eingesetzt?
Was ist die besonderheit der eingesetzten Primer? Und warum braucht man keine Ligase?
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC332407/pdf/nar00204-0127.pdf
Und dann wäre es noch hilfreich, da bei derartigen Aufgaben hier öfter Missverständnisse aufgetaucht sind, wenn du den GENAUEN Wortlaut der Aufgabenstellung posten würdest.
Und was konkret hat die Aufgabe mit dem GST-Tag zu tun? Ich verstehe den Zusammenhang nicht ganz, ausser, dass das Tag dein Produkt letztendlich wahrscheinlich N-terminal flankieren soll.
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RNA?- just another nucleic acid? |
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benny89
Gast
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| Verfasst am: 12. Dez 2011 14:14 Titel: |
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bei dieser klonierung hat man einmal einen LIC-Vektor, der mit Pme1 geschnitten wird. Vektor besitzt 3'-enden ohne dATP. der Vektor wird dann mit der T4-Polymerase und dATP behandelt. diese polymerase baut 3'-Enden bis zum ersten dTTP ab. das enthaltene dATP wird komplementär zum T eingebaut und es entsteht ein Überhang. Das gleiche wird mit dem Insert durchgeführt. Überhänge des vektors und des inserts sind komplementär und lagern sich aneinander.(deshalb braucht man keine Ligase) Das komstrukt wird dann in z.B. Ecoli transformiert. richtig so? aber was so besonders an den primern sein soll weiß ich nicht....
und die aufgabe lautet: erkläre wie aus dem pDEST15-vektor ein LIC-kompatibler Expressionsvektor hergestellt wird. Tausche dazu die Gateway-kassette gegen die LIC-Kassette aus (überBsrGI-Stellen).
Hinweis: readingframe beachten des Expressionsvektors. |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 13. Dez 2011 09:41 Titel: |
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| benny89 hat Folgendes geschrieben: | | bei dieser klonierung hat man einmal einen LIC-Vektor, der mit Pme1 geschnitten wird. |
Der pDest15 hat gar keine Pme1-Schnittstelle 
Eigentlich kenne ich das so, dass sowohl der Vektor als auch das Insert PCR-amplifiziert werden und zwar mit Primern, die die Überhänge der LIC-Kassette (z.B. ALU-Sequenzen) tragen. diese werden dann entsprechend mit der T4-Polymerase behandelt, so dass der LIC-Überhang entsteht. Dann binden die komplementären Überhänge von Insert und Primer über Basenpaarung aneinander, eine kovalente Verknüpfung entsteht aber nicht. Das Plasmid wird dann transformiert und e. coli "repariert" das "kaputte" Plasmid und erzeugt die kovalente Verknüpfung des Rückrates.
| benny89 hat Folgendes geschrieben: | | Überhänge des vektors und des inserts sind komplementär und lagern sich aneinander.(deshalb braucht man keine Ligase) |
Doch was unterscheidet diese Überhänge von z.B. sticky-Enden von Restriktionsenzymen?
Warum kann man zweitere nicht ligaseunabhängig klonieren?
| benny89 hat Folgendes geschrieben: | | aber was so besonders an den primern sein soll weiß ich nicht.... |
Sie müssen die entsprechenden Überhänge beinhalten.
| benny89 hat Folgendes geschrieben: | | erkläre wie aus dem pDEST15-vektor ein LIC-kompatibler Expressionsvektor hergestellt wird. Tausche dazu die Gateway-kassette gegen die LIC-Kassette aus (überBsrGI-Stellen). |
Wie sieht denn deine LIC-Kassette aus?
pDest15 hat 3 BsrGI-Schnittstellen. Du würdest also das Fragment von der attR1-site bis zur attR2-site entfernen, das wäre dann ja o.K.
Das mit dem PmeI -Schnitt verstehe ich nur noch nicht....
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benny89
Gast
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| Verfasst am: 13. Dez 2011 10:42 Titel: |
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also das Pme1 bezieht sich auch nicht auf den pDEST15...hab das nur so beschrieben wie wir das gelernt haben. und uns wurde auch nicht gesagt wie LIC-Vektor und-Insert für diese Klonierung generiert werden sondern Vektor und INsert waren schon fertig sozusagen (ist alles theoretisch übrigens). und dann wurde mit dem Enzym (bei uns Pme1) geschnitten. so dass blunt end enstanden sind. und dann gings halt so weiter wie bereits beschrieben. Deswegen kann ich auch nicht sagen wie die LIC-Kassette aussieht..und im netz ist auch nichts zu finden...
"Doch was unterscheidet diese Überhänge von z.B. sticky-Enden von Restriktionsenzymen?
Warum kann man zweitere nicht ligaseunabhängig klonieren?"
also zu deinen fragen weiß ich keine antwort...
und wie meinst du dass man das fragment von der attR1- nis zur attR2-site entfernen würde? irgendiwes teht ch grad aufm schlauch... |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 13. Dez 2011 11:10 Titel: |
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| benny89 hat Folgendes geschrieben: | | und im netz ist auch nichts zu finden... |
Hast du den Artikel gelesen, den ich dir gepostet habe?
Da ist das Prinzip eigentlich ganz schön beschrieben.
| benny89 hat Folgendes geschrieben: | | also das Pme1 bezieht sich auch nicht auf den pDEST15...hab das nur so beschrieben wie wir das gelernt haben. und uns wurde auch nicht gesagt wie LIC-Vektor und-Insert für diese Klonierung generiert werden sondern Vektor und INsert waren schon fertig sozusagen (ist alles theoretisch übrigens). |
Verstehe ich nicht. Sollst du dann einfach ein PmeI-geschnittenes Fragment in die BsrGI-sites klonieren?
| benny89 hat Folgendes geschrieben: | "Doch was unterscheidet diese Überhänge von z.B. sticky-Enden von Restriktionsenzymen?
Warum kann man zweitere nicht ligaseunabhängig klonieren?"
also zu deinen fragen weiß ich keine antwort... |
Na ja, sticky ends haben ja auch zueinander komplementäre Sequenzen, die sich gegenseitig über Basenpaarung "erkennen".
Doch die LIC-Sequenzen sind üblicherweise wesentlich länger, normalerweise > 10 Nukleotide.
Man kann das auch nicht nur mit dATP machen, da wäre auch jedes andere Nukleotid vorstellbar. Es wird das Nukleotid gewählt, das zu dem Nukleotid komplementär ist, welches die Überhänge flankiert. So "nagt" die Exonuklease den Strang nur bis zu eben diesem Nukleotid ab.
Wird der LIC-Überhang also von einem T flankiert, so setzt man dATP ein. Das kannst du dir anhand der Abbildung 1 des geposteten Papers verdeutlichen.
| benny89 hat Folgendes geschrieben: | | und wie meinst du dass man das fragment von der attR1- nis zur attR2-site entfernen würde? irgendiwes teht ch grad aufm schlauch... |
Schau dir den Vektor noch mal genau an. Wo liegen die BsrGI-sites?
Der pDest15 verfügt über 3 BsrGI-Schnittstellen, die erste liegt in der attR1- site, die zweite in dem ccdB-Gen und die dritte in der attR2-site.
Schneidest du mit dem Enzym, erhälst du also 3 Fragmente. Das grösste davon (also dein "backbone") reicht dann also von der 5'-Seite der attR1-Sequenz zu der 3'-Seite der attR2-Sequenz. Das kleinste repräsentiert das Stück von der "Mitte" des ccdB-Gens bis zur attR2-site und das dritte von der 3'-Seite des attR1-Elementes bis in das ccdB-Gen.
Betrachtest du also die äussersten beiden BsrGI-Schnittstellen, so schneidest du damit Teile der attR1-Sequenz, die Chloramphenicol-Resistenz, das ccdB-Gen und Teile der attR2-site heraus. Ich schätze, dieser Teil soll durch deine LIC-Kassette ersetzt werden.
Von welchem Gen sollst du das Leseraster brücksichtigen? Wie sieht das aus?
Hast du die Sequenzmerkmale deiner Insertion?
Und noch einmal die Frage: Was hat das Ganze mit dem Expressionsverhalten zu tun, das durch das GST-Tag angeblich zustande kommen soll (Stelle bitte den Bezug zu deiner Eingangsfrage her, so dort einer existiert)?
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benny89
Gast
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| Verfasst am: 13. Dez 2011 11:21 Titel: |
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also Pme1 spielt hier jetzt keine rolle...das brauchst du einfach nicht zu beachten.
wenni ch mir den vektor angucke dann sehe ich da keine BsrGI-Stellen. wo soll dass denn da zu finden sein? in der Map des vektors jedenfalls nicht...
informationen über das insert hab ich nicht. Da steht nur: nach der LIC-Klonierung einer proteinkodierenden Sequenz muss das Protein von Interesse an den Tag korrekt (in frame) fusioniert sein.
und das mit dem Tag ist eine andere Aufgaben...da soll ich wie gesagt sagen worin dessenvorzüge liegen....
Aber erstmal noch zu der Generierung des LIC-Expressionsvektors: da spielt doch das Insert erstmal keine rolle oder? und warum muss ich da die Überhänge per PCR anbauen und vor allem wie? ich kann mir das irgendwie nciht vorstellen... |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 13. Dez 2011 12:00 Titel: |
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| benny89 hat Folgendes geschrieben: |
wenni ch mir den vektor angucke dann sehe ich da keine BsrGI-Stellen. wo soll dass denn da zu finden sein? in der Map des vektors jedenfalls nicht... |
Ich habe mir die Sequenz angeschaut und nach den Schnittstellen gesucht. Da bin ich darauf gestossen.
Die vollständige Sequenz findest du z.B. hier:
https://www.lablife.org/g?a=seqa&id=vdb_g2.ce367qvgpwjre8trgocv6.dlets-_sequence_aee39f03bddd092fa1f46455cf5aa3de46dce0d2_10
| benny89 hat Folgendes geschrieben: | | informationen über das insert hab ich nicht. Da steht nur: nach der LIC-Klonierung einer proteinkodierenden Sequenz muss das Protein von Interesse an den Tag korrekt (in frame) fusioniert sein. |
Aber dazu brauchst du doch den Abstand von BsrG-site und GST....
| benny89 hat Folgendes geschrieben: | | Aber erstmal noch zu der Generierung des LIC-Expressionsvektors: da spielt doch das Insert erstmal keine rolle oder? und warum muss ich da die Überhänge per PCR anbauen und vor allem wie? ich kann mir das irgendwie nciht vorstellen... |
Bitte lies dazu die Publikation, die ich dir oben gepostet habe.
Hier wäre noch eine, die womöglich interessanter für dich sein könnte:
http://www.medschool.lsuhsc.edu/biochemistry/Courses/Biochemistry201/Chiu/pep02-25-8-pMCSG7_LIC-cloning.pdf
Ist das ungefähr das, was du machen sollst?
Und die Insertion ist da in meinen Augen nicht egal, es sei denn, du sollst einfach eine Insertion an die BsrGI-Schnittstellen klonieren. Dann kämen aber doch die PmeI-Schnittstellen ins Spiel, sie flankieren schliesslich das Insert. Oder verstehe ich da irgendetwas falsch?
Woher nimmst du denn die LIC-Überhänge, wenn du sie nicht mittels PCR an deine Produkte "anbaust"? Oder sollen die BsrgI-sites die sein?
Wenn du den Vektor mit BsrGI-schneidest und meine hypothetischen Annahmen bzüglich des backbones richtig sind, so brauchst du eigentlich nur wenige Nukleotide des Vektors mit T4-Polymerase exonukleatisch abbauen, da die BsrGI-Schnittstelle von einem GTT flankiert wird, so dass nach Schneiden die Sequenzen
(1) 5'-AGTTT-3'
und an dem komplementären Strang
(2) 3'-TCAAACATG-5'
(der BsrGI-Überhang ist fett markiert). Wenn du nun den Überhang-Strang (2) bis zu dem T verdaust (also T4-Polymerase mit dTTP), so entsteht da ein 5'-GTTT-3'-Überhang.
Fällt dir was auf?
PmeI hat die Erkennungssequenz GTTTAAAC und schneidet blunt in der Mitte dieser Sequenz. So könntest du durch T4-Pol-Verdau des Inserts bereits eine Komplementarität zwischen der BsrGi- und der Pme-site generieren. Dies trifft zumindest für die 5' gelegene BsrGI-site zu, für die 3'-gelegene müsste ich das noch prüfen.
Ob diese kurzen Überhänge allerding ausreichen, um Ligaseunabhängig zu klonieren, weiss ich nicht.
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 13. Dez 2011 12:15 Titel: |
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Für die 3' gelegene BsrGI-site gilt das leider nicht.
Da ist die Sequenz (ich habe das mal geschnitten):
5'-(Insert)-AGC TTT CTT------- GTA CAA AGT-(backbone)-3'
3'-(Insert)-TCG AAA GAA CAT G ------TT TCA-(backbone)-5'
Da würdest du mit der gleichen Methode bis zum T des oberen stranges (rechte Seite) verdauen, hättest also einen 3'-TTTC-5' Überhang des unteren Stranges (rechte Seite). Die drei Ts wären o.K., doch das C ist problematisch, da bei deinem Pme-geschnittenen und T4-Pol verdauten Insert an dieser Stelle auch ein C in dem komplementären Strang stünde (5'-AAAC-3').
Ich würde das aber erstmal als Lösungsvorschlag so einreichen und dann schauen....
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