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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
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 Verfasst am: 30. März 2013 14:00 Titel: Gelelektrophoresebild Chorea Huntington |
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Hi,
ich habe hier im Neurologiebuch (Lehrbuch der Neurologie von Sitzer und Steinmetz) ein Bild von der Gelelektrophorese nach Gentest auf Chorea Huntington.
Das Problem ist, dass ich mir nicht erklären kann woher die ganzen Banden kommen.
Da ich das Bild nicht im Web gefunden habe:
Auf jeder Spur mit Probe von Patienten sind jeweils 2 Cluster von 2-3 Doppelbanden zu sehen. Gut die beiden Cluster leuchten mir ein, da es sich um die 2 Allele des Huntingtingens handeln dürfte.
Was ich nicht verstehe, sind die 2-3 Doppelbanden pro Cluster. Wenn ich das richtig sehe, wurden hier PCR Produkte aufgetragen. Kommen diese Doppelbanden durch kürze Amplikationsprodukte der PCR zustande? Der Größenunterschied sollte in der unterschiedlichen Anzahl an CAG- Repats liegen, sodass man die Anzahl der Repeats aus dem Molekulargewicht der Banden errechnen und so die Diagnosestellen kann.
LG und Danke Firelion
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It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
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PaGe
Moderator
Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3549
Wohnort: Hannover
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| Verfasst am: 30. März 2013 14:52 Titel: |
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Das Bild kann man sich bei amazon anschauen. Seite 255. Erklären kann ich es dir aber auch nicht.
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Die deutsche Rechtschreibung ist Freeware, du darfst sie kostenlos nutzen. Aber sie ist nicht Open Source, d. h., du darfst sie nicht verändern oder in veränderter Form veröffentlichen. |
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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
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| Verfasst am: 30. März 2013 14:56 Titel: |
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Genau das Danke 
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 31. März 2013 20:09 Titel: |
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Ich kann das Buch bei Amazon irgendwie nicht einsehen (liegt vielleicht an "no script", weiss aber auch nicht genau, welches script ich aktivieren müsste...); kannst du direkt zu dem Bild verlinken?? Dann kann ich dir womöglich bei der Interpretation helfen...
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RNA?- just another nucleic acid? |
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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
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| Verfasst am: 31. März 2013 20:25 Titel: |
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Ich kann bei Amazon leider auch nicht an das Bild ran.
Aber dieses Bild ist sehr ähnlich:
http://www.karger.com/Article/ShowPic/70854?image=000070854_f01.JPG
Nur der Marker ist etwas anders und im Neurologiebuch sind für jedes allel zwei bis drei dieser Doppelbanden.
Was mir noch einfallen würde, wäre ein Artifakt bei der Detektion ähnlich dem Westernblot, wenn zu viel sekundärer Antikörper gebunden hat.
Ich hätte da ehrlich gesagt ein problem die "richtige" Bande zu erwischen.
EDIT:
Das Bild sieht aus wie ein Southern-Blot, oder? Verursacht ein "Zuviel" an gebundener Gensonde auch so einen Effekt?
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 01. Apr 2013 19:32 Titel: |
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| Firelion hat Folgendes geschrieben: | | Das Bild sieht aus wie ein Southern-Blot, oder? Verursacht ein "Zuviel" an gebundener Gensonde auch so einen Effekt? |
Ich würde eher sagen, dass es sich um ein Gelelektrophoresebild nach PCR handelt, so etwas ist aber schwer zu beurteilen. Bei einem Southern-Blot würde ich jedoch grössere Fragmente erwarten. Schaut man sich die Repeat-Anzahl im Stammbaum an und addiert dazu noch die flankierenden Sequenzen bis zu den Primerbindungsstellen, so passt das in etwa. Da ich die Umgebungssequenzen des Huntintin-Gens allerdings auch nicht genau kenne und die hier verwendeten Primer ebensowenig, weiss ich halt nicht, ob eventuell nicht auch die Restriktionsschnittstellen der verwendeten Endonucleasen in der Entfernung "Bandengrösse minus Repeatlänge" liegen. Auch im Southern-Blot würde ich keine definierten Banden als unspezifischen Hintergrund erwarten. Wenn man nicht vernünftig blockiert oder wäscht, zeigt sich der Hintergrund eher als so ein Schmier und nicht derartig diskret und definiert.
Im Moment kann ich dir auch nicht sagen, woher die Doppelbanden kommen, könnte sein, dass die Primer in degenerierter Weise auch kurz neben der Zielsequenz binden, zumal die Banden ja unabhängig von der Probe in etwa die gleiche Entfernung in Basenpaaren zueinander aufweisen. Kann ich aber die Woche mal nachlesen.
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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
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| Verfasst am: 01. Apr 2013 22:05 Titel: |
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Danke
Das Prinzip hinter dieser Methode ist eine PCR mit den Primern für das Huntingtingen bzw der Region mit den CAG-Repats, oder? Wird der Rest des Gens mittels Restriktionsenzym von den Repeats getrennt?
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 01. Apr 2013 23:22 Titel: |
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Bei der PCR werden Primer eingesetzt, die die Repeats flankieren. Abhängig von der Entfernung der Primerbindungsstellen von den Repeats ist das entstandene Fragment dann entsprechend grösser.
Ein Restriktionsverdau wird vor einem Southern-Blot durchgeführt, damit das Genom "zerstückelt" wird. Nach Gelelektrophoretischer Auftrennung und Transfer auf eine geeignete Membran wird mit Sonden der Bereich markiert, in dem die entsprechenden Repeats zu erwarten sind. Abhängig von der Entfernung der Restriktionsschnittstellen von den Repeats sind auch diese Fragmente entsprechend grösser.
Insofern könnte das Bild beides sein. Schauen wir uns einmal den Sohn ganz links in dem Stammbaum an (Nr. 18): Da sind zwei Banden, eine bei knapp 100bp und die andere bei knapp 110bp. Seine beiden Allele für das Huntigton-Gen enthalten nun einmal 17 und einmal 19 Repeats, was 51 und 57 bp entspräche. Der Unterschied zwischen den dargestellten Bandengrössen und der Repeatlänge könnte nun zum einen auf die Entfernung der Repeats von den Primerbindungsstellen (PCR) oder von den Restriktionsschnittstellen (Southern) zurückzuführen sein.
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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
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| Verfasst am: 01. Apr 2013 23:38 Titel: |
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Ah danke.
Also wenn ich das richtig verstehe gibts es prinzipiell zwei Möglichkeiten auf die Repeatlänge zu ermitteln:
1. Restriktionsverdauu der genomischen DNA und dann Southernblot + Sonde (analog zum Vaterschaftstest/ genetischen Fingerabdruck mittels RFLP, oder ?)
oder
2. PCR und dann direkt auf das Gel.
Bei der zweiten Methode spart man sich dann den Blot?
Stimmt das soweit?
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 02. Apr 2013 09:53 Titel: |
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Southern blot wird bei dieser Fragestellung heutzutage jedoch eher selten durchgeführt.
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