Genidentifizierung - Notch Signalweg

Keks2 · Anmeldungsdatum: 02.04.2013 Beiträge: 1

Meine Frage:
Wie kann man genomweit neue Gene identifizieren, die am Notch Signalweg beteiligt sind?

Meine Ideen:
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jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Mir ist nicht ganz klar, ob du Gene identifizieren möchtest, deren Produkte Bestandteil des Notch-Signalweges sind (so weit ich weiss, ist die Signalkaskade, die gerade durch die Internalisierung des extrazellulären Teiles des Notch-Rezeptors ausgelöst wird, nicht ausreichend charakterisiert) oder ob du nach Genen suchst, die durch den Notch-Signalweg reguliert werden.

Ich nehme zunächst einmal an, zweiteres trifft zu. Dann kannst du den Signalweg stimulieren und mit CHIP-Experimenten schauen, welche Gene im Vergleich zu einer unbehandelten Probe herauf- oder herunterreguliert werden.
Zur Kontrolle, ob die Induktion des Signalweges funktioniert hat, solltest du auf jeden Fall zuerst einen Western Blot durchführen, um zu schauen, ob gut charakterisierte und für die Signaltransduktion essentielle Proteine auch entsprechend phosphoryliert werden. Für viele Proteine sind Antikörper erhältlich, die nur die phosphorylierte oder nur die unphosphorylierte Form eines Proteins erkennen.

Wie du allerdings gerade diesen Signalweg induzierst, weiss ich nicht und auch nicht, welche Proteine daran konkret beteiligt sind. Aber das Vorgehen ist eigentlich stets ähnlich: Signalweg durch adäquaten Reiz induzieren, schauen, ob er auch wirklich induziert wurde und genomweite Expressionsanalyse.

Dann kannst du noch verschiedene Spielereien anschliessen oder ergänzen: z.B. Luciferase-Reporter-Assays unter Kontrolle eines Notch-abhängigen Promotors, in denen die Luciferase nur exprimiert wird, wenn der Signalweg induziert wird. Oder du kannst dir einzelne Gene, die du im CHIP als "Hits" identifiziert hast, herauspicken und gezielt in entsprechenden Expressionssystemen untersuchst oder vieles andere. Das o.g. "Basisvorgehen" reicht meist für eine ausreichende Validität nicht aus, es werden meistens noch zusätzliche Experimente verlangt, um deine auf dem z.B. CHIP basierenden Hypothesen zu untermauern.