Microarray Normalisierung

Jaykowski · Anmeldungsdatum: 18.04.2015 Beiträge: 3

Hallo liebes Forum,
ich beschäftige mich gerade mit der Expressionsanalyse verschiedener Gene durch Affymetrix Microarray Chips. Dabei stoße ich auf Begriffe, mit denen ich leider nicht viel anfangen kann.

In einer Abbildung ist die absolute Expression angegeben (einheitenlose Werte zwischen 0 und 2000), in der Beschreibung steht "GCOS normalization: TGT (100)". Bei GCOS handelt es sich wohl um eine Affymetrix Software und bei TGT um einen "Target value". Die erhaltenen Messungen werden, wenn ich soweit richtig verstehe, irgendwie normalisiert, um sie vergleichbar zu machen. Leider finde ich nirgendwo eine Beschreibung, wie so etwas funktioniert. Was sagt mir eine Expression von z.B. 500? ist sie hoch, oder niedrig? und was ist der Unterschied zwischen TGT (100) oder TGT (200)? grübelnd

Ich würde sehr gerne die Grundlagen verstehen.

Vielleicht kennt sich ja jemand damit aus oder kennt einen Link, in dem ich nachlesen kann. Hilfe

Liebe Grüße,
Jay

Hedera · Anmeldungsdatum: 08.03.2011 Beiträge: 657

Ich kann dir nicht genau sagen, was das für eine Normalisierung ist. Es gibt viele Möglichkeiten Expressionswerte zu normalisieren.

Die grundsätzliche Idee bzw. das grundsätzliche Problem ist, dass nie exakt viel Ausgangsmaterial beim Versuch hattest. Ein Gen kann zB. einen Expressionswert habe, der 10 mal höher in A verglichen zu B ist. Nun stellt sich die Frage ob das Gen in A tatsächlich 10 mal höher expremiert ist. Es könnte ja auch sein, dass du in A nur mehr RNA, cDNA oder so drin hattest. Um solche Unterschiede zu vermeiden normalisierst du. Die Normalisierung von A und B führt dann zB. dazu, dass dein Gen in A plötzlich nur noch 3 mal mehr expremiert ist.
Eine Möglichkeit der normalisierung ist beispielsweise das nutzen von sogenannten Houskeeping-Genes. Das sind Gene die zB. grundlegende Stoffwechselwege regulieren und daher in deinem Versuch nicht anders expremiert werden. Das heißt also, wenn diese Gene in A und B verschieden stark "expremiert" sind, dann liegt das tatsächlich daran, dass du mehr Material in einer Probe hattest.
Es gibt noch viele verschiedene Normalisierungsstrategien und wie sie im Detail arbeiten muss man sich dann auch wirklich im einzelnen Angucken. Für einen allgemein Überblick solltest du mal im Internet nach Normalisierungsstrategien suchen. Tatsächlich gibt es auch eine große Diskussion welche Strategien gut sind und welche nicht. Houskeeping-Genes werden zB. inzwischen als unverlässlich bezeichnet. Sie funktionieren aber unter bestimmten Bedinungen (erfahrungsgemäß) sehr gut. Man muss also auch gucken wann man welche anwenden kann.

Vielleicht hilft dir das ja noch weiter:
http://repository.countway.harvard.edu/xmlui/bitstream/handle/10473/4713/hummel_affy_normalization.pdf?sequence=1

Sonst google einfach mal "Affymetrix normalisation". Da solltest du was finden Zwinkern

Jaykowski · Anmeldungsdatum: 18.04.2015 Beiträge: 3

Ach, so hängt das zusammen smile

Das Verwenden von Housekeeping Genen kenn ich von der qRT-PCR, also machen die bei diesen Arrays im Prinzip was ähnliches.

Was ich halt nicht verstehe ist, wenn ich eine qRT-PCR mache, dann achte ich darauf, dass das Housekeepinggen stabil bleibt unter Kontroll- Testbedingung. Dann bekomm ich Ct Werte raus und rechne so lang hin und her, bis ich am Ende den Fold-Change der Expression im Vergleich zur Kontrolle herausbekomme.

Aber ich verstehe nicht, was diese absolute Expression sein soll...

Vielen lieben Dank für deine Antwort, ich schau mir die Folien mal an, google und melde mich, falls ich es verstanden habe smile

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Hi,

unter absolut würde ich den gemessenen Wert verstehen, während relativ der Quotient zwischen irgendetwas ist also Testbedingung/ Kontrolle.

LG Firelion

Jaykowski · Anmeldungsdatum: 18.04.2015 Beiträge: 3

Ja, da würde ich dir recht geben Aber mir sind die Verhältnise nicht klar und in was die Expression dann angegeben ist, wie zum Beispiel "Intensität von Fluoreszenz".

Bei einem Menschen zum Beispiel weiß ich, dass die Größe in m gemessen werden kann und dass 1,15m klein ist und 2m groß.

grübelnd

Hedera · Anmeldungsdatum: 08.03.2011 Beiträge: 657