Gelelektophorese Protokoll

Aleera · Anmeldungsdatum: 02.03.2007 Beiträge: 14 Wohnort: BaWü

Hi, ich schon wieder^^

Wink

Habe eine Hausaufgabe erhalten die lautet:
Arbeiten Sie ein Versuchsprotokoll für einen vollständigen EcoRI- und HindIII-Restriktionsverdau und EcoRI/HindIII-Doppelverdau von jeweils 600ng Lambda-DANN in 20μL Gesamtvolumen mit anschließender Restriktionsanalyse unter Verwendung von folgenden Materialien aus:
• Agarose
• 50 x TAE-Elektrophoresepuffer
• Lambda-DNA (0,3mg/mL)
• EcoRI (10U/μL)
• HindIII (10U/μL)
• 10 x Restriktionspuffer
• Destilliertes H2O
• 5μL Lambda-HindIII-Längenstandart mit Ladepuffer
• 6x-Ladepuffer
• Ethidiumbromidlösung (10mg/mL)
Für die Reaktionsanalyse soll ein 0,8%-iges Agarosesegel verwendet werden, Für die anschließende Gelfärbung soll eine wässrige Ethiudiumbromidlösung (0,5μg/mL) verwendet werden

Mein bisheriger Ansatz:
1. 8g in 1000mL entsprechen einer 0,8%igen Lösung. Um 80 mL 0,8%-iges Agarosegel herzustellen, werden 0,64g Agarose abgewogen und in einen Erlenmeyerkolben gegeben.
2. Um 500mL 1 x TAE-Elektrophoresepuffer herzustellen, 10mL 50 x TAE-Elektrophoresepuffer mit 490mL destilliertem Wasser vermischt
3. 80mL des TAE-Puffer zu der Agarose geben, die Agarose löst sich nicht im Puffer
4. Den Erlenmeyerkolben bei 360Watt in die Mirkowelle stellen. Die Lö-sung schmelzen lassen, vor dem Überlaufen aus der Mikrowelle nehmen. Um sicher zu sein, dass die Agarose sich vollständig gelöst hat, im Gegenlicht auf Schleierbildung prüfen. Ist die Lösung noch nicht ganz klar, muss die Lösung noch einmal erhitzt werden.
5. Gel abkühlen lassen auf etwa 65°C. Währenddessen die Elektrophoreseapparatur vorbereiten
6. Gel von einer Ecke aus in das Schiffchen gießen, eventuelle Luftblasen mit Pipettenspitze beseitigen.
7. Großen Kamm in die Halterung am Rand des Schiffchens einsetzen.
8. Ohne Erschütterung erkalten lassen, den Elenmeyerkolben sofort reini-gen.
9. Platten der Kammer entnehmen, Gelbett ohne es zu berühren mit den Geltaschen zum Minuspol ausrichten.
10. Gellkämme vorsichtig und langsam nach oben aus dem Gel ziehen.
11. Restlichen TAE-Elektrophoresepuffer in die Gelkammer füllen, bis das Gel gerade vollständig bedeckt ist, maximale Füllhöhe der Kammer be-achten.
12. Zwischen 50 und 100 μL des TAE-Puffers mit der Pipette aufnehmen und die Geltaschen vorsichtig damit auffüllen, um die Luft zu verdrän-gen. Die Geltaschen dürfen mit der Pipettenspitze nicht durchstochen werden.
13. Jeweils 600ng (= 0,6μg) Lambda-DNA sollen in einer Probe sein, bei einer Konzentration von 0,3mg/mL (= 300μg/mL) benötigt man also 0,002mL = 2μL der Lambda-DNA in jeder Probe. In drei markierte Tubes werden je 2μL pipettiert.
14. In den vierten Tube werden die 5μL Lambda-HindIII-Längenstandart pipettiert.

Jetzt habe ich das Problem, dass ich nicht weiß, wie viel Restriktionspuffer ich zu den Restriktionsenzymen geben muss. Wahrscheinlich muss ich auf 1 x verdünnen, aber wie finde ich heraus, wie viel μL ich benötige? Bei den Restriktionenymen muss ich laut Lehrerin so viel hinzu pipettieren, dass die DNA in einer Stunde "verdaut" ist. Und wie funktioniert das mit dem Lambda-HindIII-Längenstandart mit Ladepuffer? Wenn jede Probe 20μL sein muss, soll ich dann mit Wasser verdünnen oder fehlt in dieser Probe noch iwas?

Hilfe

Ich weiß, dass das jetzt viel Text von mir ist, aber wäre super, wenn sich jemand die Mühe machen würde, es zu lesen! Finde im Internet nichts so spezifisches, Wiki liefert auch nichts genaues....
...oder ich kann einfach nicht suchen, wäre natürlich auch möglich^^

Bye, Aleera

WissenXtreme · Anmeldungsdatum: 10.10.2004 Beiträge: 69

Hallo!
Also erst einmal du hast das Ethidiumbromid vergessen dabei zu tun, dies geschieht nach dem Erhitzen der Agarose-Gel-Lösung und zwar sehr vorsichtig, da das, so wie ich gelernt habe, nicht grade ungefährlich, sondern im Gegenteil gefährlich ist. Also Sicherheitshandschuhe tragen.

So nun zu deinem Ansatz. Also die Gel herstellung, so wie ich sie überflogen habe, scheint gut zu sein. Nun zu dem Restriktionsverdau. Du musst die Restriktionsenzyme natürlich vorher zu der DNA geben, denn mit dem Gel überprüfst du nur noch, ob die Enzyme an der richtigen Stelle geschnitten haben.

Die Lambda-Lösung gibst du in einen Streifen extra, um einen Vergleichswert zu haben, da dort genau die Balken erscheinen und du nach Vorlage ablesen kannst, wie viele Basenpaare welche MArkierung entspricht. Hoffe dir geholfen zu haben. Bei weiteren Fragen, schreib einfach nochmal