Southern-Blot

Bacillus Anthracis · Anmeldungsdatum: 18.03.2010 Beiträge: 5

Meine Frage:
Hallo Leute!

Ich habe im Zuge einer Genotypisierung (kappa-Casein eines Stiers: A, B oder AB) unter anderem einen Southern-Blot durchgeführt, um meine Fragmente zu identifizieren.

Das Ergebnis deckt sich mit dem, das ich per Agarose-Gelelektrophorese des entsprechenden Restriktionsverdaus erhalten habe. So jetzt zur eigentlichen Frage:

Beim Southern-Blot sind die Banden stark verwischt, sie beginnen zwar bei der richtigen Höhe (ca 404 bp), ziehen sich dann aber ein gutes Stück hinauf. Wie kann das passieren?

Beste Grüße,

A

elementum · Ehrenmitglied Anmeldungsdatum: 30.04.2006 Beiträge: 485 Wohnort: HD

ehrlicher weise musste ich in meinem leben einen einzigen southern machen, weshalb ich hier nur vermuten kann. auf der anderen seite mache ich tagtäglich western blots, die sich ja nicht allzu sehr unterscheiden (in der blot methode zumindest).

der fehler bei "komischen banden" liegt immer entweder am gel oder am aufbau des blots.

die meisten fehler liegen am blot. da wären so sachen wie "luftblase zwischen gel und membran" oder auch "ungleichmäßige spannung innerhalb des gels" (was z.B. auch durch luftblasen, aber auch durch eine in der dicke variierende papierschicht entstehen kann).

am gel können sich beim gießen intern verdichtungen und verwirbelungen bilden. bei polyacrylamid gelen passiert das weniger häufig, da du die aktivatoren hinzugibst und sofort das gel gießt, bei agarose kann es schon häufiger passieren, da du den "optimalen" punkt zum gießen meist verpasst/nie erreichst. auch solche verdichtungen führen zu verschwommenen banden auf der membran.

letzte möglichkeit die mir einfällt ist ein falsch zusammengesetzter transfertpuffer. passiert schnell mal, dass man sich um ne 10er potenz irrt oder verrechnet hat, was teils schon dramatische auswirkungen auf den transfert haben kann.

so, das waren jetzt meine ideen; hoffentlich lößt sich dadurch das problem =)

Bacillus Anthracis · Anmeldungsdatum: 18.03.2010 Beiträge: 5

hmm ja das ist einiges dabei, was mir logisch erscheint! danke für die hilfe, ich muss in meinem protokoll begründen "was ich sehe" Augenzwinkern

bisher wars auch mein erster southern-blot, western-blots hab ich schon mehrere hinter mir.

ich hab den southern-blot nach dieser methode durchgeführt:
http://www.gbiosciences.com/EducationalUploads/EducationalProductsImages/mediumimages/Southern%20Blot.jpg

kein wunder, dass das nicht funktioniert, steinzeit olé -.-

im wahren laboralltag macht man das mit angelegter spannung oder?

Lg