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EP
Gast
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 Verfasst am: 10. Jun 2012 16:23 Titel: Mikroinjektion |
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Hey,
ich bräuchte mal dringend eure Hilfe, denn mir stellen sich ein paar Fragen auf die ich bisher leider noch keine Antwort finden konnte.
Undzwar werde ich meine mündliche Prüfung in Bio über Gentechnik, genauer gesagt über einen transgenen Lachs halten. Ich musste leider feststellen, dass es doch erheblich schwieriger ist als ich zuerst gedacht hätte. 
Was ich schon weiß ist, dass die transgene DNA später per Mikroinjektion in die befruchteten Eizellen gespritzt wird. Verstehe ich das richtig, dass auch hier ein Plasmid als Vektor benutzt wird? Oder wie geht das von statten?
mfg EP |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 13. Jun 2012 15:06 Titel: Re: Mikroinjektion |
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| EP hat Folgendes geschrieben: |
Was ich schon weiß ist, dass die transgene DNA später per Mikroinjektion in die befruchteten Eizellen gespritzt wird. |
Das ist eine Möglichkeit, andere findest du z.B. hier
| EP hat Folgendes geschrieben: | | Verstehe ich das richtig, dass auch hier ein Plasmid als Vektor benutzt wird? |
Nö, hier wird lineare DNA eingesetzt.
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RNA?- just another nucleic acid? |
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EP
Gast
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| Verfasst am: 14. Jun 2012 00:43 Titel: |
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Hey Jörg,
danke für deine Antwort. Leider schockiert sie mich doch etwas, denn ich habe eigentlich wirklich gedacht dazu würde ein Plasmid verwendet.
Anscheinend verstehe ich da was falsch, aber was?
| Zitat: | The vector used to prepare the AquAdvantage construct is a bacterial (E. coli) plasmid
called pUC18, which contains the gene for beta-lactamase (bla), an enzyme that confers
resistance to ampicillin (amp^r) and is used as a selectable marker in plasmid-cloning
operations. Less than 50 bp of this plasmid DNA has been introduced into the GE fish
genome, none of which encodes bla or any other gene of bacterial origin. |
[Habe ich hier raus: fda.gov/downloads/AdvisoryCommittees/CommitteesMeetingMaterials/VeterinaryMedicineAdvisoryCommittee/UCM224760.pdf und der genaue Lachs ist der hier aquabounty.com/products/products-295.aspx wollte ich eigentlich schon letztes mal posten aber man darf ja keine Links eintragen]
Was wird denn dann überhaupt für eine DNA benutzt? Wie kann man dann z.B. feststellen ob die gewünschten Gene an der richtigen Stelle eingebaut wurden? Wir haben den immer nur mit Plasmiden behandelt aber nicht sowas. Da bin ich echt ratlos.
Über eine vielleicht etwas ausführlichere Antwort würde ich mich sehr freuen. 
mfg EP |
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EP
Gast
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| Verfasst am: 14. Jun 2012 12:17 Titel: |
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Ich habe jetzt noch etwas gesucht und noch was gefunden, doch wirklich schlau werde ich leider daraus auch nicht:
| Zitat: | | The founder animal from which the AquAdvantage Salmon line derives was a mosaic, transgenic female (EO-1) generated in 1989 by micro-injecting a linearized form of opAFP-GHc2 into the fertilized eggs of wild Atlantic salmon. |
| Zitat: | Das eingebrachte rekombinante DNA (rDNA)-Konstrukt (opAFP-GHc2) enthält die cDNA des Gens für ein Wachstumshormon (growth hormon, GH) aus dem Königslachs (Oncorhynchus
tshawytscha), der wie alle Lachse vom Menschen verzehrt wird. Die das GH-kodierende cDNA steht unter der Kontrolle der regulatorischen Nuleotidsequenzen (Promotor und Terminator) eines für ein Anti-Frost-Protein (AFP) kodierenden Gens aus dem ebenfalls essbaren Meeres-Dickkopf, Zoarces americanus (syn. Macrozoarces americanus), einer an kalte Meeresregionen angepassten Fischart. |
Also die lineare DNA die eingespritzt wird ist dieses opAFP-GHc2 und dessen cDNA enthält die gewünschten Gene die eingebaut werden müssen richtig?
Aber was ist dieses opAFP-GHc2 denn überhaupt genau und wie wurden die Gene der beiden Fische da eingebracht? Und was hat das Plasmid jetzt damit zu tun?
Sry für meine Unwissenheit, aber ich bin richtig verwirrt und es ist echt dringend. 
mfg EP |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 14. Jun 2012 18:34 Titel: |
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Also, das Plasmid benötigst du zum einen, um deine gewünschte DNA von Bakterien vermehren lassen zu können und zum anderen, um die erwünschten Sequenzen zusammenzuklonieren.
In diesem Fall wurde also die codierende Sequenz eines Wachstumshormones (GH) in ein Plasmid kloniert. Davor wurde danach (oder vorher, je nachdem) ein Promoter gesetzt, nämlich derjenige, mit dem man das Gen kombinieren möchte, also unter dessen Kontrolle es transkribiert werden soll. Das Gen muss ja nicht durch seinen "authentischen" Promoter reguliert werden; meist wird ein starker Promoter bevorzugt. in diesem Falle also den Promoter eines Anti-Frost-Proteins (AFP). Das Konstrukt hat man dann einfach "opAFP-GHc2" genannt , opAFP steht für den Promoter und GHc2 für das Gen.
Dann kann man da wahlweise noch Enhancer oder anderes hinzuklonieren. Das alles macht man in einem Plasmid über Restriktionsschnittstellen. Dann transformiert man Bakterien damit und lässt diese sein Plasmid vervielfältigen. Nun schneidet man seine Sequenz aus (also Promoter, Gen und evtl. Enhancer, Polyadenylierungssignal oder ähnliches "Zubehör") und injiziert sie mittels Mikroinjektion.
| EP hat Folgendes geschrieben: | | Wie kann man dann z.B. feststellen ob die gewünschten Gene an der richtigen Stelle eingebaut wurden? |
Tja, was ist schon die "richtige Stelle"? Wo genau das eingebaut ist, weiss man oft gar nicht, deswegen benutzt man heutzutage auch andere Techniken.
Man hätte ganz schön viel Aufwand, um genau die Stelle der Insertion zu bestimmen.
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RNA?- just another nucleic acid? |
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EP
Gast
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| Verfasst am: 14. Jun 2012 20:47 Titel: |
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Hi Jörg,
danke für deine erneute Antwort. Vielen vielen Dank dafür, du hast mir ein erhebliches Stück weiter geholfen. Ich glaube ich habe nun verstanden wie es funktioniert. Das mit dem Plasmid als "Zwischenschritt" habe ich einfach nicht geschnallt.
Ich muss mal schauen ob ich jetzt wirklich alles restlos verstanden habe und alleine hin bekomme, aber zumindest habe ich nun wieder etwas Hoffnung gefasst.
Ich werde mich also eventuell noch mal melden, wenn es doch noch Probleme geben sollte, ansonsten nochmal danke für deine Hilfe. 
mfg EP |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
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| Verfasst am: 15. Jun 2012 13:33 Titel: |
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| EP hat Folgendes geschrieben: |
Ich werde mich also eventuell noch mal melden, wenn es doch noch Probleme geben sollte |
Gerne
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RNA?- just another nucleic acid? |
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EP
Gast
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| Verfasst am: 15. Jun 2012 17:19 Titel: |
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Mir sind doch noch ein paar kleinere Fragen eingefallen: 
- Wie schafft man es, dass sich die beiden Gene der Fische genau hintereinander lagern? (Oder muss das gar nicht der Fall sein?)
- Ob das Plasmid die Gene aufgenommen hat überprüft man dann doch z.B. mit der Stempelprobe oder?
- Und nachdem man das "fertige" Plasmid hat, und die entsprechende Sequenz mit Hilfe von Restriktionsenzymen ausgeschnitten hat, wie findet man diese Sequenz? (Also woher weiß man was die Sequenz ist und was "der Rest" des Plasmides ist?)
mfg EP |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 15. Jun 2012 20:04 Titel: |
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| EP hat Folgendes geschrieben: | | Wie schafft man es, dass sich die beiden Gene der Fische genau hintereinander lagern? |
Welche beiden Gene?
Wenn du zwei Gene injizieren möchtest, musst du sie entweder in dem Plasmid "hintereinander" liegen haben oder du erhälst zwei völlig verschiedene Insertionsloci.
Eine weitere Möglichkeit wäre, sie durch einen bidirektionalen Promoter kontrollieren zu lassen, dann liegt der Promoter zwischen den beiden Genen.
Aber ich weiss nicht einmal, was konkret du meinst, also kann ich auch nur vage und spekulativ antworten.
| EP hat Folgendes geschrieben: | | Ob das Plasmid die Gene aufgenommen hat überprüft man dann doch z.B. mit der Stempelprobe oder? |
Was ist die Stempelprobe?
Oder meinst du "Stempeltechnik"?
Doch damit überprüfst du gar nichts, du kannst lediglich eine oder mehrere positive Kolonien "vermehren". Doch dazu musst du wissen, welche positiv sind.
Da bei der Erzeugung transgener Bakterien die "Ausbeute" häufig nicht so gut ist, kannst du, wenn du z.B. nur eine positive Kolonie hast, diese mittels der Stempeltechnik auf einen neuen Nährboden übertragen und da wachsen dann ganz viele Kolonien.
Ich weiss aber nicht, ob das überhaupt noch gemacht wird. Vielleicht bei schwer anzüchtbaren Bakterienstämmen...
Eigentlich enthält dein Plasmid eine Antibiotikumresistenz und du streichst die transformierten Bakterien dann auf antibiotikumhaltigem Nährboden aus. Die weitere Kultivierung würde ich dann in Flüssigmedium vornehmen und die Plasmid-DNA präparieren.
Weitere Selektionsmarker könnten z.B. das LacZ-Operon sein. Du inserierst dein "Gene of interest" in die LacZ-, so dass die Galaktosidase nicht mehr exprimiert wird. Dann kannst du X-Gal (5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside) auf die Platte streichen und die Bakterien, die noch Galaktosidase synthetisieren, werden blau (Galaktosidase verstoffwechselt X-Gal zu Galactose und dem blauen Farbstoff 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindol), während diejenigen, die das nicht mehr tun, weiss bleiben.
| EP hat Folgendes geschrieben: | | Und nachdem man das "fertige" Plasmid hat, und die entsprechende Sequenz mit Hilfe von Restriktionsenzymen ausgeschnitten hat, wie findet man diese Sequenz? (Also woher weiß man was die Sequenz ist und was "der Rest" des Plasmides ist?) |
Agarosegelelektrophorese
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EP
Gast
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| Verfasst am: 15. Jun 2012 22:14 Titel: |
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Naja der transgene Lachs enthält zum einen das Wachstumsgen eines Königs Lachses und das AFP als Promoter von einem ocean pout. Habe ich vielleicht etwas ungenau formuliert. Ich wollte wissen, wie sichergestellt ist, dass diese beiden Gene sich hintereinander im Plasmid anlagern.
Ja, ich meinte die Stempeltechnik. Mit dem ausstreichen auf ein Nährmedium mit Antibiotikum zur Überprüfung welches Plasmid die Bruchstücke aufgenommen hat. Dass ist halt die einzige Überprüfmöglichkeit die wir durch genommen haben. Und da ja auch das Plasmid pUC18 verwendet wird, welche Antibiotika Resistenz aufweist, habe ich gedacht, dass es wahrscheinlich so überprüft wird.
mfg EP |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 16. Jun 2012 13:30 Titel: |
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Beschreibe doch zunächst einmal, was ein Gen ist und wie es organisiert ist, also aus welchen "Elementen" es besteht. Ich befürchte nämlich, dass das gar nicht so klar ist.
| EP hat Folgendes geschrieben: | | Naja der transgene Lachs enthält zum einen das Wachstumsgen eines Königs Lachses und das AFP als Promoter von einem ocean pout. Habe ich vielleicht etwas ungenau formuliert. Ich wollte wissen, wie sichergestellt ist, dass diese beiden Gene sich hintereinander im Plasmid anlagern. |
In diesem Falle wurde nicht das AFP-Gen verwendet, sondern lediglich der Promoter des AFP Gens, um die Transkription des Wachstumshormon-Gens zu kontrollieren.
Um die Frage zu beantworten, wie sichergestellt werden kann, dass die beiden Elemente in einer produktiven Orientierung zueinander liegen, müsste ich von dir wissen. was du bereits über Klonierung weisst. Und: Was sind Restriktionsenzyme?
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EP
Gast
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| Verfasst am: 26. Jun 2012 16:58 Titel: |
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Sry, dass ich erst jetzt wieder antworte, aber ich vorher leider nicht die Zeit gefunden.
Ich wollte mich sowieso eigentlich nur noch mal für die nette Hilfe bedanken. Es hat alles wunderbar geklappt. Ohne die Denkanstöße die ich hier bekommen habe, wäre es bestimmt nicht so gut ausgegangen.
Also nochmal ein dickes Dankeschön.
mfg EP |
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