Zwischenklonierung

Nikki · Gast

Meine Frage:
Hallo,

Ich habe eine Frage: warum macht man, wenn man ein Gen via PCR amplifiziert hat, oft eine Zwischenklonierung (z.B. in pGem) bevor man das Fragment in den eigentlichen Vektor (z.B. ein Expressionsvektor)ligiert? Wo ist da der Vorteil, macht die Zwischenklonierung nicht nur mehr Arbeit?

Vielen Dank schon mal!

Meine Ideen:
eine eigene Idee habe ich leider nicht...

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Hi,

das macht man manchmal um z.B. die richtigen Schnittstellen einzufügen.

Außerdem kann man so auch zusätzliche Sachen wie weitere Resistenzen oder Marker einbauen.

LG Firelion

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Man macht das auch, um eindeutig Bakterien zu selektionieren, die mit dem Vektor transformiert wurden, der die gewünschte Insertion trägt; z.B. mittels ß-Gal screening ("blau-weiß-Selektion") oder mittels eines Selbstmord-Gens, welches die Bakterien bei Religation des Vektors tötet, so dass nur diejenigen überleben, die mit dem Plasmid transformiert sind, welches das gewünschte Insert beinhaltet. Desweiteren kann man mit standardisierten Primern eine Sequenzanalyse des gewünschten z.B.PCR-Fragmentes durchführen.
Ferner, wie Firelion bereits sagte, gibt es Klonierungen, die gar nicht so einfach sind, so dass man über verschiedene Zwischenklonierungen Schnittstellen isolieren muss.