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Korrekter Einbau eines Fremdgens in einen Expressionsvektor
 
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Marie465
Gast





BeitragVerfasst am: 04. Jan 2017 16:23    Titel: Korrekter Einbau eines Fremdgens in einen Expressionsvektor Antworten mit Zitat

Meine Frage:
Hallo,

kann mir jemand erklären, wie man ein Fremdgen so in einen Expressionsvektor einbauen kann, dass das korrekte Protein gebildet wird? In der Schule habe ich gelernt, dass der Expressionsvektor entsprechende Elemente wie einen geeigneten Promotor, die Ribosomenbindungsstelle und den Terminator bereits enthält, um eine Expression im Produktionsorganismus zu ermöglichen. Wie sieht es jetzt bspw. mit dem Startcodon aus? Enthält der Expressionsvektor das Startcodon oder reicht das des Fremdgens? Wenn der Expressionsvektor das Startcodon enthält, wie schaffe ich es dann das Fremdgen so in den Vektor einzubauen, dass keine zusätzlichen Aminosäuren im Protein auftauchen?

Meine Ideen:
Ich habe gelernt, dass das Fremdgen innerhalb der Multiple Cloning Site in den Vektor eingebaut wird und dass sich die Multiple Cloning Site wiederum innerhalb eines Markergens zur Selektion der Rekombinanten befindet, das bei Einbau des Fremdgens auseinandergerissen wird. Wenn sich jetzt das Startcodon direkt hinter der RBS stromaufwärts vom Markergen befindet, wird ein Teil vom Markergen und der Multiple Cloning Site ja mit dem Fremdgen in das Protein translatiert und im Protein tauchen zusätzliche Aminosäuren auf oder nicht? Ich komme da echt nicht weiter...
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 05. Jan 2017 10:05    Titel: Antworten mit Zitat

Das Gen muss eine entsprechende 5'UTR (das kann auch eine heterologe sein), die kodierende DNA ggf. inklusive einiger Introns (wenn du z.B. splicing-Phänotypen untersuchen möchtest) und eine 3'UTR inklusive der für die Polyadenylierung bedeutende Sequenzen (mind. Poly-A-site und downstream sequence element) mitbringen (auch die kann heterolog sein, wenn du z.B. regulative Elemente in der 3'UTR untersuchen möchtest). Das bedeutet, dass das Startcodon darin enthalten sein muss. Ggf. benötigst du auch die Sequenz für das Signalpeptid, wenn das exprimierte Protein über das ER synthetisiert werden soll.
Das mit dem Terminator ist nur bedingt richtig, da es für eukaryontische Gene häufig gar keine definierte Terminationsregion gibt.

Marie465 hat Folgendes geschrieben:

[...] und dass sich die Multiple Cloning Site wiederum innerhalb eines Markergens zur Selektion der Rekombinanten befindet, das bei Einbau des Fremdgens auseinandergerissen wird.


In eukaryontischen Expressionsvektoren eigentlich eher nicht, da nutzt du solche Vektoren eigentlich hauptsächlich zur Zwischenklonierung, um z.B. dein Gen zu sequenzieren. Selten, dass die MCS eines eukaryontischen Expressionsvektors sich in einem Markergen befindet.

_________________
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Marie465
Gast





BeitragVerfasst am: 05. Jan 2017 14:18    Titel: Antworten mit Zitat

Okay, danke für die Antwort. Wie sieht es jetzt aber bei einer heterologen Expression eines eukaryotischen Fremdgens in einem Bakterium aus? Ich dachte, dass ein Bakterium die für die Genexpression notwendigen Sequenzen eines eukaryotischen Gens nicht erkennen kann und dass das Gen daher kaum bis gar nicht exprimiert wird, wenn der Expressionsvektor nicht die prokaryotischen Sequenzen enthält?
Und wenn sich die MCS nicht in einem Markergen befindet, wie kann ich dann erkennen, dass der Vektor nicht religiert und tatsächlich das zu exprimierende Gen aufgenommen hat?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 05. Jan 2017 15:52    Titel: Antworten mit Zitat

Marie465 hat Folgendes geschrieben:
Wie sieht es jetzt aber bei einer heterologen Expression eines eukaryotischen Fremdgens in einem Bakterium aus? Ich dachte, dass ein Bakterium die für die Genexpression notwendigen Sequenzen eines eukaryotischen Gens nicht erkennen kann und dass das Gen daher kaum bis gar nicht exprimiert wird, wenn der Expressionsvektor nicht die prokaryotischen Sequenzen enthält?


Das ist sowiet richtig, aber das ließe sich ja beheben, indem halt die entsprechenden bakteriellen Sequenzen (Promoter und regulatorische Elemente) verwendet werden und ich von dem gewünschten Gen nur das offene Leseraster verwende. Viel problematischer ist dann, dass das entsprechende Protein zwar dann die gewünschte Primärstruktur hat, Bakterien ihre Proteine jedoch anders falten, es also sehr unwahrsceinlich ist, dass die funktionsfähigen Sekundär- und Tertiärtrukturen entstehen. Dennoch ist es möglich, Bakterien zur Synthese von eukaryontischen Proteinen zu nutzen. Ein Beispiel ist Insulin. Insulin besteht aus zwei Ketten, welche über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Diese zwei Ketten sind beim Menschen zuerst eine längere Kette, die dann gespalten wird. Diese längere Kette enthält zum einen das Signalpeptid und zum zweiten das sog. C-Protein (ein Verbindungsstück zwischen den beiden Ketten) neben den beiden Ketten. Nun wird das Protein zunächst in das ER synthetisiert, wo es dann über die Disulfidbrücken verknüpft wird (Sekundärstruktur). Danach wird die Signalsequenz und das C-Peptid abgespalten und das fertige Insulin wird über den Golgi-Apparat sezerniert. Bakterien verfügen nun weder über einen Golgi-Apparat noch über ein endoplasmatisches Reticulum. Zudem können sie die eben genannten Prozessierungsvorgänge nicht gewährleisten (korrekte Faltung, Abspaltung der "überflüssigen" Proteinbestandteile).
Also muss man diese Probleme umgehen. Das tut man, indem man jede der beiden Ketten des fertigen Insulinmoleküls (und zwar nur die Ketten ohne C-Peptid) von unterschiedlichen Bakterienstämmen synthetisieren lässt, sie aufreinigt und hinterher über die Disulfidbrücken an den Cystin-Resten verknüpft.
Nun sind leider aber nicht alle Proteine so einfach strukturiert wie das Insulin, so dass die bakterielle Synthese von eukaryontischen Proteinen meistens nicht gelingt, aber dieses Beispiel zeigt, dass es mit entsprechenden Tricks durchaus möglich ist.

Marie465 hat Folgendes geschrieben:
Und wenn sich die MCS nicht in einem Markergen befindet, wie kann ich dann erkennen, dass der Vektor nicht religiert und tatsächlich das zu exprimierende Gen aufgenommen hat?


Indem ich den Vektor mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen schneide und mein gewünschtes Gen auch mit diesen beiden Restriktionsenzymen geschnitten wird.
Ich kann z.B. eine PCR über mein Gen laufen lassen und es so erstmal vervielfältigen. An die Enden baue ich mit den Primern Schnittstellen für die Restriktionsenzyme meiner Wahl. Möglichst wähle ich für das 5'-Ende eine andere Schnittstelle als für das 3'-Ende. Dann kloniere ich das Gen in einen Vektor, welcher über ein Markergen verfügt (z.B. ß-Galaktosidase oder irgendein Selbstmord-Gen). Diese Klonierung erfolgt an glatten ("blunt") Enden (bzw. abhängig von der verwendeten Polymerase auch über T-A-Überhänge). Dann selektioniere ich meine positiven Kolonien. Da schneide ich das Gen dann mit den entsprechenden Restriktionsenzymen heraus, die "sticky" Überhänge erzeugen (dann habe ich idealerweise entsprechende Überhänge, welche an beiden Enden des Gens unterschiedlich sind) und kloniere es in den Expressionsvektor, welchen ich an der MCS mit den gleichen Enzymen geschnitten habe. So kann der Vektor nicht religieren und auch die Insertionsrichtung ist vorgegeben.
Das wäre der Optimalfall. Leider ist das nicht immer möglich, so dass man tatsächlich manchmal blunt ligieren muss und Religationen sowie Insertionen mit falscher Insertionsrichtung in Kauf nehmen muss. Dann mache ich das immer so, dass ich verschiedene Klone picke und sie mit einem Restriktionsverdau auf das Vorhandensein des Gens untersuche. In einem zweiten Schritt überprüfe ich dann mit einem weiteren Restriktionsverdau die Insertionsrichtung (meistens mache ich das in einem Schritt, aber die Darstellung der Zweischrittigkeit verdeutlicht das Vorgehen besser). Im ersten Schritt wähle ich die Restriktionsenzyme, mit denen ich auch kloniert habe. Im zweiten Schritt wähle ich Restriktionsenzyme, von denen eines im Vektor liegt und das andere in dem Gen. Anhand der Fragmentlängen kann ich dann die richtige Insertionsrichtung erkennen.

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