southern-blotting

ka boga · Anmeldungsdatum: 29.11.2006 Beiträge: 4 Wohnort: Paderborn

hallo, ich habe ein problem: ich schreibe am mittwoch meine bio-lk-klausur und habe aber noch nicht ganz verstanden, was es mit dem southern-blotting auf sich hat! ich habe schon alle möglichen bücher gewälzt, aber niergends steht drin, warum man das macht.... beim DNA.fingerprint werden ja die fragmente in der gelelektophorese der länge nach aufgetrennt. dann werden die DNA-stücke mit einer alkalischen lösung denaturiert und dann kommt irgendwie diese abdruckmethode southern-blot.... -.- und dann kommen ja auch irgendwie mit einer folie die radioaktiv markierten sonden darauf, die überschüssigen abgewaschen und mit nem röntgenfilm sichtbar gemacht! ich habe ja soweit alles verstanden, nur das mit dem abdruck macht mir sorgen...wäre wirklich schön, wenn mir da wer weiterhelfen kann.... stelle dann auch mal meine klausur-aufgaben online, für alle mitleidenden zum üben Zwinkern

danke im vorraus
ciaoi, ka boga^^

bille · Anmeldungsdatum: 14.01.2007 Beiträge: 43

also ich schreibe facharbeit über den genetischen fingerabdruck Zwinkern

vll kann ich dir helfen
beim southern blot werden die fragmente vom gel auf eine nylonmembran übertragen,denn nur diese kann man später mit uv licht behandeln und somit das bandenmuster sichtbar machen

so hab ichs beschrieben
Eine Flüssigkeit, z.B. Salzlösung, zieht die DNA mit.
Die Unterseite des Gels wird mit einer Salzlösung in Kontakt gebracht.
Anschließend wird auf das Gel eine Nylonmembran, bzw. eine Nitrozellulosemembran, gelegt und darüber ein Stapel saugfähiges, trockenes Papier. Das ganze wird dann mit etwas Druck beschwert. Diese Papierschicht wirkt wie eine Art Schwamm und lässt die Salzlösung durch das Gel diffundieren. Diese läuft von unten über das Gel auf die Membran, da sich darüber saugfähiges Material befindet.
So gelangt sie zunächst durch das Gel und dann an die Nylonmembran. Die sich im Gel befindende DNA wird dadurch mit der Salzlösung an die Membran geschwemmt und bleibt dabei in den Maschen der Membran hängen.
Der Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Flüssigkeit 10 bis 12 Stunden laufen muss und ein hoher Verbrauch der Salzlösung einhergeht.

vll hilft dir des ja was
glg Wink

bille · Anmeldungsdatum: 14.01.2007 Beiträge: 43

ah sry hab nen teil vergessen
und nach dem southern blot wird dann die membran in eine hybridisierungslösung gegeben in der sich eben diese sonden befinden.
die hybridisieren dann mit den bestimmten fragmenten und danach erfolgt dann eine visualisierung

so hoffe des wars etz
falls du noch fragen hast vll kann ich dir noch weiterhelfen Zwinkern

baba

Noctu

Hallo bille !
Ich bin froh mit Dir jemand zu haben der sich mit Molekularbiologie auskennt und sein Wissen auch mit den anderen teilt, meine Paradedisziplin ist Moli beileibe nicht weinen

Zu Deinen oberen Beitrag hab ich aber zwei kleine Anmerkungen:
- Die DNA wird beim blotten nicht über die Diffusion der Salzlösung bewegt, sondern es sind Kapillarkräfte die die Flüssigkeit in das Papier saugen ( wir hatten immer ein Stapel Papierhandtücher vom Klo genommen Big Laugh

) der Vergleich mit dem Schwamm triffts aber !
- Die DNA bleibt auf der Membran nicht in den Maschen hängen, dazu sind die Maschen ( besser Poren ) zu grob und die DNA zu klein, es sind Ladungsunterschiede die die DNA an der Membran immobilisieren.

Einverstanden ?
Grüße,
N.

bille · Anmeldungsdatum: 14.01.2007 Beiträge: 43

ja des mit dem kapilliarblot is mir klar:D

aba damit solche kräfte wirken muss man eben eine flüssigkeit verwenden,oda??? weil sonst is ja nichts da

und des mit den maschen des is ein guter tip
vielen dank Tanzen

weil des hab ich so übernommen und wusste net ganz sicha was damit gemeint is Big Laugh

glg

Noctu

M!cha · Anmeldungsdatum: 22.12.2006 Beiträge: 52

Was noch fehlt ist:
Nach dem Gel-Lauf muss zunächst das Gel in NaOH inkubiert werden. Dadurch denaturieren die DNA-Doppelstränge zu Einzelsträngen. Die Einzelstränge werden dann auf die Membran geblottet. Nur so kann später auch die Sonde an den komplementären Abschnitt hybridisieren.
Nach dem blotting muss die Membran mit einer unspezifischen-DNA "geblockt" werden um die freien Stellen der Membran zu besetzen. Ansonsten würden hier später Sonden unspezifisch binden und Signale geben.
Wink