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pcr-agent
Anmeldungsdatum: 13.03.2008
Beiträge: 4
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 Verfasst am: 15. März 2008 18:46 Titel: kann eine Genexpression nachvollzogen werden? |
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Hallo Leute,
ich brauche mal wieder eure Hilfe!
Und zwar frage ich mich, ob man mit den folgenden Daten beweisen kann, dass ein bestimmtes Protein exprimiert worden ist..oder nicht!?
Und zwar hat man zunächst die optische Dichte (OD) einer Bakterienkultur gemessen..nach einer Stunde lag diese bei 0,168, nach einer weiteren bei 0,52 (Zunahme um den Faktor 3,1)...jetzt wurde ein Induktor hinzugegeben und das ganze erneut inkubiert...
es verging wieder eine Stunde, wobei OD=1,663 (Zunahme um 3,2)....dann nach einer weiteren Messung nachc einer Stunde bei 1,683...
kann man mit diesen Werten nun wirklich beweisen, dass ein Protein exprimiert wurde? Oder zumindest die Vermutung verfestigen, dass eventuell eine Proteinsynthese stattgefunden hat?!
Wäre euch sehr verbunden, wenn ihr mir eine gute Erklärung abliefern könntet;-)
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PaGe
Moderator
Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3549
Wohnort: Hannover
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| Verfasst am: 15. März 2008 22:41 Titel: |
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mE nicht. WIe du die Steigerung schon angegeben hast, waren die Werte ja eigentlich zu erwarten. Die sicherste Variante ist, das Protein wirklich mit einem Antikörper nachzuweisen oder zumindest die Proteine im Gel zu untersuchen, um dann eine stark ausgebildetet neue Bande festzustellen. |
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Bert
Anmeldungsdatum: 26.09.2007
Beiträge: 82
Wohnort: Niedersachsen
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| Verfasst am: 15. März 2008 23:27 Titel: Re: kann eine Genexpression nachvollzogen werden? |
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| pcr-agent hat Folgendes geschrieben: |
kann man mit diesen Werten nun wirklich beweisen, dass ein Protein exprimiert wurde? Oder zumindest die Vermutung verfestigen, dass eventuell eine Proteinsynthese stattgefunden hat?!
Wäre euch sehr verbunden, wenn ihr mir eine gute Erklärung abliefern könntet;-)
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Bei einem Zellwachstum kannst du mit Sicherheit sagen, daß eine große Anzahl von Proteinen synthetisiert wurde (Enzyme, Zellwand- und Strukturproteine usw.), aber selbst die Zunahme an Biomasse (bei dir nur eine erhöhte OD, was nicht zwangsläufig Biomassenzuwachs bedeuten muß!) ist kein Beweis für die Synthese eines bestimmten (womöglich heterolog exprimierten) Proteins.
Was hast du induziert? Welche Funktion hat das bestimmte Protein? Das Protein kannst du entweder an seiner Größe (z.B. SDS-PAGE) sehen/nachweisen, oder besser an seiner spezifischen Funktion (z.B. die Umwandlung eines Substrats zum Produkt; du weist dann in deiner Kultur/Zellextrakt das Produkt nach).
Es gibt aber einige Fälle, wo man es auch schon anhand von Wachstum mit ziemlicher Sicherheit sagen kann:
1. Ist das Bakterium gegen ein bestimmtes Antibiotikum sensitiv, das Antibiotikum ist im Kulturmedium in einer tödlichen Dosis, und du kannst ein deutliches Zellwachstum (erhöhte Zellzahl) nachweisen/beobachten, so ist das ein starker Hinweis dafür, daß ein bestimmtes Enzym (z.B. ein heterolog exprimiertes Enzym, das spaltet das Antibiotikum) synthetisiert wurde.
2. Falls du ein definiertes Kulturmedium mit einer einzigen Kohlenstoffquelle hast, und das Bakterium soll ein Enzym synthetisieren, das ihm ermöglicht, diese Kohlenstoffquelle zu verwerten, dann ist das Zellwachstum auf dieser Kohlenstoffquelle ein starker Hinweis dafür, daß dieses Protein/Enzym synthetisiert wurde.
Wenn nichts davon für deinen Fall zutrifft, schreib einfach ein paar Infos zu dem Protein, das du nachweisen willst, dann kann ich dazu auch mehr sagen.
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Holzhacken ist deshalb so beliebt, weil man bei dieser Tätigkeit den Erfolg sofort sieht. [Albert Einstein] |
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pcr-agent
Anmeldungsdatum: 13.03.2008
Beiträge: 4
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| Verfasst am: 18. März 2008 15:42 Titel: |
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hallöchen;-)
Danke erst einmal für die Antworten.
Das Problem ist, dass das SDS-Page und das Western-Blotting danach noch einmal gemacht wurden...
nun will ich aber erst einmal etwas zu dieser OD-Bestimmung schreiben, weiß aber nicht recht WARUM wir diese gemacht haben. (Der TA meinte dazu nur "der Induktionsverlauf soll nachvollzogen werden").
Vor allem war das Protein, das synthetisiert werden sollte in unserem speziellen Fall eine Totmutante...sie wurde also gar nicht exprimiert (oder nur verkürzt). Die OD-Kurve ist aber ganz normal ausgefallen...wie kann ich so etwas denn auswerten?
Ist vielleicht der letzte Anstieg (von 1,663 auf 1,683) etwas niedrig? Kann hieraus etwas interpretiert werden?
Aaaah Leute..ich bin am Verzweifeln  |
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