Photometrische Bestimmung für pH-Optimum der Katalase

Jaamar · Anmeldungsdatum: 14.06.2010 Beiträge: 119

Meine Frage:
Hallo!
Ich musste in einem Praktikum den Optimalen pH-Bereich für das Enzym Katalase (aus Leberextrakt) herausfinden.
Dabei haben wir folgende Puffer verwendet:
Citratpuffer (3-5)
Acetatpuffer (4-6)
Phosphatpuffer (6-8)
Tris/HCl (7-9)
Ich habe die Werte nach 0 und nach 120 Sekunden gemessen und davon die Differenz genommen. Dabei kamen, vorallem im pH-Bereich 3-4,5 (=6 Messungen) negative Differenzen heraus.
Diese Werte muss ich natürlich auch Diskutieren und ich hab auch eine Idee, jetzt frag ich mich, ob das plausible ist und ob es vielleicht auch noch eine andere Erklärung geben könnte.

Zur praktischen Umsetzung: Ich habe Puffer (1,8ml) und verdünntes Extrakt (200µl) in die Küvette gegeben. Zum Schluss gab ich 1 ml Substrat (H2O2) hinzu und versuchte es damit ordentlich zu vermischen.

Meine Ideen:
Genau hier liegt glaub ich der Grund. Durch die Zugabe von H2O2 konnte ich die Lösung nicht ordentlich genug vermischen (gemessen wurde photometrisch die H2O2-Konzentration). Durch den niedrigen pH und der daraus folgenden Inaktivität des Enzyms wurde kaum H2O2 abgebaut. Weiters vermischte sich das H2O2 mit der Zeit immer besser mit der restlichen Lösung, wodurch es zu einer "KOnzentrationszunahme" im Strahlengang des Photometers.

beste Grüße und Danke

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Deine Erklärung wäre natürlich prinzipiell möglich.
Solltest du die Trinder- Methode verwendet haben, käme prinzipiell auch noch eine pH- Abhängigkeit der Geschwindigkeit ( oder anders geartete Verzögerung) der Farbreaktion in Betracht.

Jaamar · Anmeldungsdatum: 14.06.2010 Beiträge: 119

trinder-methode sagt mir nichts.
die mischung bestand nur aus leberextrakt (durch 2-fache ammonusulfatfällung gereinigt), dem jeweiligen puffer und dem substrat.

danke auf jeden fall für die antwort!

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Und Absorptionsinterferrenzen mit dem Citratpuffer sind auszuschließen?

Jaamar · Anmeldungsdatum: 14.06.2010 Beiträge: 119

gab es, hab dazu auch die eigenenabsorbtion des puffers gemessen. aber da es sich ja um differenzwerte handelt (nach 0 und 120 sekunden), bleibt das ergebnis ja gleich.

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Tja, dann würde ich es mit o.g. Erklärung auch versuchen oder das Ganze wiederholen.
Ich erinnere mich auch daran, daß das alte Eppendorff- Photometer, das wir damals benutzten, oft unzuverlässig arbeitete, was mich nicht selten in Erklärungsschwierigkeiten brachte....
Aber das wird wohl wenig hilfreich sein.
Sorry....

Jaamar · Anmeldungsdatum: 14.06.2010 Beiträge: 119

wiederholen ist leider nicht mehr drinnen, dazu fehlt einfach die zeit *gg*.
wichtig ist nur, dass ich die werte irgendwie begründen kann, auch wenn sie nicht logisch sind und da hab ich ja einen ansatz!
auf jeden fall vielen dank für die mühen!

aja und alt war das photometer auch Big Laugh

beste grüße