Studium : Hochdurchsatzsequenzierung, Pyrosequencing

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Hi,

ich bin mir nicht ganz sicher, ob ich den Unterschied der Methoden richtig verstanden habe.

Beim Pyrosequencing habe ich eine einzige DNA Matrix und fixiere diese. Anschließend gebe ich nur eine Sorte dNTP dazu. Habe ich das richtige erwischt, kommt es zur Abspaltung von PPi und es leuchtet. Dann wäscht man alle nicht gebundenen NTPs ab und gibt die nächste Sorte dazu. So erhält man dann jede Base einzeln.

Beim Hochdurchsatzsequencing kann ich ein DNA Gemisch nehmen wie z.B. ein vollständiges kleines Genom opder das Genom einer Tumorzelle. Die DNA Fragmente versieht man mit speziellen Linkermolekülen und fixiert diese so in einer Platte. Auf diese Platte kommen zusätzlich noch nicht ligierte Linker oben drauf. Jetzt kann ein freies Ende praktisch an einem freien Linker binden und es kommt ortsgebunden zu einer PCR. Hier gibt man alle 4 ddNTPs die unterschiedlich markiert sind hinzu und keine dNTPs. Bindet ein ddNTP kommt es zum Stop der Polymerisation, das Signal wird ausgelesen und spezielle Chemikalien dazugeben die das Weiterschreiten der Polymeration erlauben. So bekommt man schnell viele Sequenzen analysiert. Ein Nachteil ist, aber dass alle Sequenzen schon in einer Datenbank gespeichert sein müssen, damit man die vielen Ergebnisse für das Gemisch dann mittels BLAST zu ordnen kann.

Stimmt das alles soweit ?

Wenn ich jetzt nur ein Insert überprüfen wollen würde, würde ich also entweder Cycle Sequencing (Sanger) oder Pyrosequencing nehmen und wenn ich aber ein ganzes Genom sequencierenwollen würde das Hopchdurchsatzsequencing ?

Danke und LG Firelion

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Ah Danke

Wir hatten nur dieses Verfahren kennen gelernt.
Meint das ganze Next Generation sequencing einfach nur, dass man nicht mehr die Fragmente nach größe Auftrennt sondern die Basen in gleich beim Einbaz registriert ?

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Ich weiss nicht, ob das die Definition ist, es ist aber eine Gemeinsamkeit der Sequenzierungsverfahren der zweiten Generation.

Firelion · Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878

Ah gut Danke. smile

Es ist schwer was genaues zu finden, überall steht zwar etwasvon gelfrei und Next generation Sequencing. Und weil das so neu ist, wird in den Lehrbüchern zwar Sanger und vielleicht noch Pyrosequencing erklärt.

Dann merk ich mir , dass dies diverse Verfahren sind, um Gemische von DNA zu sequencieren ohne vorher eine Gelelektrophorese machen zu müssen. Wie das genau geht, hängt vom Hersteller des Kits ab.