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lucky25
Gast





BeitragVerfasst am: 18. Mai 2015 10:13    Titel: western blot Antworten mit Zitat

Meine Frage:
Hallo! ich habe mal eine frage zum western blot. Der dient ja dazu, proteine zu detektieren mittels antikörper. aber kann damit auch die protein expression bestimmt werden? dachte damit kann man nur zeigen, ob das protein vorhanden ist oder nicht, aber nicht in welcher menge? oder bin ich da falsch?
und dann frag ich mich auch welche rolle beta-aktin spielt? warum wird es eingesetzt?

Meine Ideen:
über hilfe würd ich mich freuen!!
Firelion



Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 18. Mai 2015 12:32    Titel: Antworten mit Zitat

Hi,

wenn man eine Ladekontrolle mitführt (zum Beispiel beta- Aktin), kann man die Proteinexpression sowohl qualitatativ (also ja/ nein) als auch quantitativ) bestimmen. allerdings braucht man dazu dann Software.


LG Firelion

_________________
It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett
lucky25
Gast





BeitragVerfasst am: 18. Mai 2015 12:38    Titel: Antworten mit Zitat

und was bedeutet es, wenn ich die Proteinexpression relativ zum beta-aktin habe? wie muss ich mir das vorstellen?
und man hat ja dann banden von dem beta-aktin und banden von dem Protein. was sagt das denn aus wenn man die vergleicht? einfach nur das beta-aktin vorhanden ist und protein auch? oder erfährt man dann noch mehr?
lucky25
Gast





BeitragVerfasst am: 18. Mai 2015 12:49    Titel: Antworten mit Zitat

ich hab mal ein beispiel bei google gesucht, damit man sich das vorstellen kann was ich meine. wenn man relative expression beta-actin eingibt, dann meine das zweite bild in der zweiten Reihe. da steht was mit V1 V2 O1 usw.
Firelion



Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 18. Mai 2015 13:34    Titel: Antworten mit Zitat

Nornalerweise vergleicht man ja verschiedene Bedingungen also zum Beispiele verschiedene Zelltypen oder verschiedene Behandlungen. Die Ladekontrolle sagt aus, ob jedes Mal gleich viel Protein geladen wurde.


Damit sieht masn dann, ob das spezielle Protein das einen interessiert im Verhältnis zum Gesamtprotein mehr oder weniger. Dafür braucht man dann allerdings mindestens zwei Bedingungen.

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lucky25
Gast





BeitragVerfasst am: 18. Mai 2015 13:46    Titel: Antworten mit Zitat

du meinst dass einfach von der Menge her gleich viel aufgetragen wurde?
das mit dem gesamtprotein ist mir nicht ganz klar: wenn ich z.B. die expression eines proteins untersuche zwischen zwei Zelltypen (wie Kontrolle und untersuchte Zelle), kann man dann z.B. sagen, dass das Protein im verlgeich zur kontrolle geringer exprimiert ist auf proteinebene? wie ist das mit dem gesamtprotein gemeint?
und ist es dann richtig wenn ich sagen, dass durch western blot das Protein-level bestimmt wird?
und wenn jetzt zwei banden vorhanden sind und die vom untersuchten protein ist schwächer als die vom beta-aktin, was sagt dass dann? das nicht die gleiche menge aufgetragen wurde? wenn nicht gleich viel aufgetragen wurde, was ist dann?
Firelion



Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 18. Mai 2015 14:10    Titel: Antworten mit Zitat

Ja, es beweist, dass ingesamt gleich viel Protein aufgetragen wurde also = Gesamtprotein (= alle Proteine, die die Zelle hatte). Das ist notwendig damit man sicher ist, dass ein beobachter Effekt bzw. dessen ausbleiben nicht daran liegt das man weniger oder mehr Gesamtprotein aufgetragen hat weil z.B. mehr Zellen von der einen Sorte vorhanden war.


Das eine Bande im Vergleich zur Ladekontrolle dicker oder dünner ist sagt erstmal wenig aus. Du musst die ,,Dicke" der Bande von deinem Protein durch die ,,Dicke" der Ladekontrolle dieser Probe teilen und dann die relative ,,Dicke" zwischen den Proben vergleichen.


Dann sieht man, ob es zwischen den Proben also Zelltzypen/ Behandlungen/ Zeitpunkten etc. Unterschiede in der Expression des Zielproteins gab.


Wenn man als Ladekontrolle Zytoskelletproteine nimmt, ist es normal dass das weniger von dem Zielprotein als von der Ladekontrolle in der Probe hat, weil man z.B. mehr Aktin als einen ganz bestimmten Transkriptionsfaktor erwartet. Das Aktin dient nur der Normalisierung des Proteingehaltes der Proben.

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Lucky25
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BeitragVerfasst am: 18. Mai 2015 20:06    Titel: Antworten mit Zitat

Das heißt also Beta-aktib dient einmal als ladekontrolle und einmal der Normalisierung, richtig? Und Western blot kann man nutzen um ein Protein nachzuweisen und um die Menge an exprimierten protein zu bestimmen, richtig?
Firelion



Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 18. Mai 2015 20:18    Titel: Antworten mit Zitat

Ja.
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Lucky25
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BeitragVerfasst am: 18. Mai 2015 20:36    Titel: Antworten mit Zitat

Dankeschön smile
Lucky25
Gast





BeitragVerfasst am: 19. Mai 2015 13:55    Titel: Antworten mit Zitat

Ich hab jetzt ne genexpression mittels qPCR und ne Proteinexpression mittels Western blot gemacht. Diese sind aber genau gleich. Was bedeutet das jetzt? Es ging dabei um die Regulation eines Gens/Proteins.
Firelion



Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 19. Mai 2015 14:25    Titel: Antworten mit Zitat

Was quantifizierst du denn mut der qPCR? Also was misst man da?
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Lucky25
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BeitragVerfasst am: 19. Mai 2015 14:34    Titel: Antworten mit Zitat

Die Expression von einer mRNA (mtpn) und dann beim Western blot die Proteinexpression (MTPN).
Firelion



Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 19. Mai 2015 19:15    Titel: Antworten mit Zitat

Naja,

du misst nicht die mRNA mit einer qPCR sondern die cDNA dieser mRNA.

Die qPCR sagt also indirekt etwas darüber aus, ob mehr oder weniger von einer mRNA vorliegt. Mehr mRNA kann zu mehr Protein führen - muss es aber nicht.


Westernblot sagt etwas über die Proteinmenge aus. Mehr Protein kann durch mehr mRNA begründet sein - muss es aber nicht.


Wenn jetzt also Westernblot und qPCR das selbe aussagen, spricht das für?

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Lucky25
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BeitragVerfasst am: 19. Mai 2015 20:09    Titel: Antworten mit Zitat

Na ich würd sagen, dann ist aus derselben Menge an mRNA dieselbe Menge Protein geworden? Und kann man dann sagen dass das Protein nicht unter den gegebenen Bedingungen beeinflusst wird? Ich dachte man könnte dadurch dann vllt auch sagen ob das Protein auf mRNA oder Protein Ebene reguliert wird. Stimmt das? Ich sollte nämlich schaun ob das Protein durch ein bestimmtes regulatorprotein (ich nenn es jetzt mal so) reguliert wird...
Firelion



Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 19. Mai 2015 20:39    Titel: Antworten mit Zitat

Genau, dann lässt sich die Zunahme der Proteinexpression durch eine Zunahme der Transkription erklären.

Wenn sowohl mRNA als auch Protein zunehmen/abnehmen dann wird die Proteinexpression beeinflusst.

Mit der Kombination aus Westernblot und qPCR dient der Bestätingung, dass eine Änderung der Transkription mit einer Änserung der Expression einhergeht.

Die Proteinexpression wird ja auch noch auf Translationeller Ebene und posttranslationell reguliert. Dewegrn sagt ein Wsternblot erstmal nichts über die Transkription und eine qPCR nichts über die Translation/ Proteinexpression aus. In der Kombination hingegen geht dies.

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lucky25
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BeitragVerfasst am: 19. Mai 2015 20:48    Titel: Antworten mit Zitat

ok also heißt dass, das das darauf hindeutet, dass mein Protein durch das Regulatorprotein auf Proteinebene reguliert wird? oder was genau hat das nun zu bedeuten?
und was wäre denn, wenn nur die Genexpression z.B. verringert wäre, und die Proteinexpression nicht (diese wird mit z.B. gegenüber einer Kontrolle gleich sein) oder geht das gar nicht?
Firelion



Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 19. Mai 2015 21:45    Titel: Antworten mit Zitat

Das sagt aus, dass die Transkription und Proteinexpression gleichermaßen verändert wurden, und somit die Änderung der Proteinexpression durch erne Änderung der Transkription erklärt werden kann.


Doch das geht. entweder durch eine effektivere Translation oder eine längere ,,Proteinlebendauer".

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lucky25
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BeitragVerfasst am: 19. Mai 2015 21:50    Titel: Antworten mit Zitat

also kann man sagen, dass das mein protein durch das regulatorprotein reguliert wird? du meintest ja das die änderung der proteinexpression durch änderung der transkription bewirkt wird. kann ich dann sagen das mein regulatorprotein das untersuchte protein auf mRNA-Ebene beeinflusst?
ich versuch grad ne schlussfolgerung daraus zu ziehen...
Firelion



Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 19. Mai 2015 21:56    Titel: Antworten mit Zitat

Das hängt von deiner Behandlung ab. Die Experimente sagen nur, dass die Transkription und Proteinexpression in gleicherweise beeinflusst wurden.

Wodurch und wie hängt von deinem Experiment ab.

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lucky25
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BeitragVerfasst am: 19. Mai 2015 22:03    Titel: Antworten mit Zitat

naja bei mir zeigt sich sowohl bei Genexpression als auch bei Proteinexpression eine verringerung. oder kann man dann nicht mehr dazu sagen, aus das die expression jeweils reduziert wird?
Firelion



Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878

BeitragVerfasst am: 19. Mai 2015 22:42    Titel: Antworten mit Zitat

Wie gesagt das hängt davon ab, was du gemacht hast.


Mann kann sicherlich sagen, dass beides verringert iat und dass die Verringerung der Proteinexpression wohl durch die verringerte Transkription bedingt ist.

Vermutlich hat die Behandkung damit zu tun. Je nachdem was du gemacht hast, kann man jetzt vermuten was dies auslöst.

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