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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
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 Verfasst am: 21. Feb 2014 16:50 Titel: Gentherapie: Genreparatur |
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Hi,
normalerweise wird bei der Gentherapie eine zusätzliche Kopie des gesunden Allels eingebracht d.h. die beiden eigenen Allele werden niht verändert. Das funktioniert an sich ja für monogenetische rezessiv vererbten Erkrankungen.
Bei dominant vererbten Erkrankungen würde man damit ja nur helfem können, wenn 50 % Wildtyp-Aktivität nicht ausreichen, denn pathologische ,,gain of function" Mutationen bleiben ja dadurch bestehen.
Da könnte ein knockdown des defekten Allels (bei Hetereozygoten) mittels sh RNA helfen
Jetzt gibt es die Idee das defekte Allel stattdessen zu reparieren, in dem man ein Vektor mit dem Wildtypallel in die Zelle einbringt und hofft, dass nach einem DNA Doppelstrangbruch dieser als Vorlage für die homologe Rekombination genutzt wird. Dies scheint in vitro zu funktionieren, in dem man mit spezifischen Nukleasen direkt von und nach der Mutationen Doppelstrangbrüche produziert. Die Zellen würden sich dann auch ähnlich wie Knock out Zellen screenen lassen also mit Neomycin und Gangcyclovir, oder?
Das dass bei Erkränkungen des hämatopoiertischen Systems funktionieren könnte, erscheint mir logisch, da masn hier ja hämatopietische Stammzellen verwenden könnte und diese dann mittels autologer Knochenmarkstransplantation wieder in den Patientem bringen kann.
Aber was ist mit Tumoren oder anderen Organen wie dem Gehirn? Hier bleibt ja nur in vivo Transfektion also mittels Viren. Das heißt aber das man in einem Virus die Nukleasen und das Wildtypallel koduieren müsste, weil beim Verzicht auf die Nukleasen die wahrscheinlichkeit für Doppelstramgbrüchen an der passenden Stellen zu gering wäre, oder?
Aber der Platz in Viren ist ja auch begrenzt und Retroviren können nur sich teilende Zellen befallen. Wenn masn jetzt einen virus mit den Nukleasen und einen Virus mit dem Wildtypallel benutzen würde, wäre duie Wahrscheinlichkeit dass beide Viren die selbe Zelle infizieren zu klein, oder?
Außerdem wären da ja noch die generellen Problem der viralen Vektoren wie erhöhtes Tumorrisiko oder eine hohe Immunigenität.
Stimmt das soweit?
LG und Danke
Firelion
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It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 22. Feb 2014 18:19 Titel: Re: Gentherapie: Genreparatur |
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| Firelion hat Folgendes geschrieben: | | Bei dominant vererbten Erkrankungen würde man damit ja nur helfem können, wenn 50 % Wildtyp-Aktivität nicht ausreichen, denn pathologische ,,gain of function" Mutationen bleiben ja dadurch bestehen. |
Na ja, es gäbe perspektivisch auch die Möglichkeit, nicht unbedingt mittels shRNA-Genen, sondern z.B. auch mit snRNAs. Bei einer Mutation, bei der es z.B. durch ein prämatures Stop-Kodon zu NMD kommt, kann man z.B. U7-snRNAs verpacken und transduzieren, bei denen die RNA-Ereknnungsdomäne komplementär zu den flankierenden Spleißstellen des Exons ist, in dem das Stop-Kodon sich befindet. Dadurch können dann die entsprechenden spleißosomalen Proteine nicht mehr binden, es kommt zum exon-skipping mit einem zwar trunkierten, aber unter Umständen funktionsfähigen Genprodukt. Die Wirkungsweise dieser Art von Gentherapie ist erfolgreich bei einigen Dystrophien gezeigt worden.
Als Anmerkung sei noch hinzugefügt, dass keinesfalls gesagt werden kann, dass wenn ein Allel mutiert ist, die Wildtyp-Aktivität 50% beträgt. Bei nur ganz wenigen Genen korrelliert die Transkriptionsaktivität mit der Proteinmenge bzw. der Genprodukt-Aktivität. Daneben sind auch Mutationen in nicht-kodierenden Bereichen zu berücksichtigen, die regulatorische Auswirkungen haben (Auch Mutationen in kodierenden Bereichen können zusätzlich zur Veränderung des Codes eine regulatrische Funktion verändern).
| Firelion hat Folgendes geschrieben: | | Aber was ist mit Tumoren oder anderen Organen wie dem Gehirn? Hier bleibt ja nur in vivo Transfektion also mittels Viren. |
Hier meinst du "Transduktion" und nicht "Transfektion", oder?
| Firelion hat Folgendes geschrieben: | | Das heißt aber das man in einem Virus die Nukleasen und das Wildtypallel koduieren müsste, weil beim Verzicht auf die Nukleasen die wahrscheinlichkeit für Doppelstramgbrüchen an der passenden Stellen zu gering wäre, oder? |
Na ja, welches wären denn die "passenden Stellen"? Ein Retrovirus z.B. bringt seine Rekombinase ja mit, inseriert dann aber womöglich in der Nähe eines Onkogens oder was auch immer, und wenn das Onkogen dann durch den viralen Promoter aktiviert wird, gibt es ein Problem. Es ist schwierig, hier "passende Stelle" zu definieren.
| Firelion hat Folgendes geschrieben: | | Aber der Platz in Viren ist ja auch begrenzt und Retroviren können nur sich teilende Zellen befallen. |
Es gibt ja nicht nur Retroviren, auch z.B. AAV kommt für Gentherapien in Betracht. Dann werden sowohl teilende als auch ruhende Zellen transduziert und das Genom inseriert nicht. Vorteil wäre, dass er nicht in Bereichen inserieren kann, die "ungünstig" sind, Nachteil, dass das Genom bei der Teilung womöglich verloren geht. Da kann man dann versuchen, ein Gen mit einzubringen, dessen Produkt das Episom am Chromatin "fixiert", damit es bei der Zellteilung nicht verloren geht. Die Kapazitäten eines AAV-Gentherapiesystems sind etwas grösser als die eines Retrovirus. In der Tumortherapie wurde auch mit verschiedenen Herpesviren gearbeitet, allerdings mit mässigem Erfolg. Aber wer weiss, vielleicht erlebt ja der ein oder andere als gescheitert angenommene Versuch eine Renaissance...
Immerhin stehen wir da noch ziemlich am Anfang...
Wenn wir mit regulatorischen RNAs arbeiten, haben wir aber eigentlich kein Platzproblem bezüglich der Kapazitäten viraler Gentherapiesysteme.
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RNA?- just another nucleic acid? |
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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
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| Verfasst am: 22. Feb 2014 18:34 Titel: |
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Ja, ich meinte Transduktion.
Das mit den snRNA war die "Umwandlung" von DMD zur BMD, oder?
Wenn ich das riochtig verstehe ist die Idee bei der Genreoaratur x Nukleotide vor der Mutation einen doppelstrangbruch zu setzen und dann darauf zu hoffen, dass bei homologen Rekombination das Oligonukleotid als Matrize genommen wird.
Wenn man jetzt nur das Oligonukleotid verwenden würde, üsste man ja auf den Zufall hoffen, dass spontan genau an Position x ein Doppelstrangbruch auftitt.
Und das halte ich für nicht sejhr wahrscheinlich.
Ja, aber AAV gibt es doch mit der Immunigenität der Viren Probleme oder nicht ? Kam es da nicht schon zu Leberversagen?
EDIT:
Ich habe jetzt rausgefunden, dass es mehrere Ansätze zur Genreparatur gibt:
Laut Strachnan und Read könnte man mit Zinc finger Nukleasen dazu nutzen ein Allel zu inaktivieren oder durch induzierte Doppelstrangbrüche ein Allel zu reparierem (durch homologe Rekombination).
Hier:
http://www.jci.org/articles/view/19419
erwähnen die Autorem der Reviews doe Möglichkeit Oligonukleotide fürs alternative Splicing zu nutzen oder die DNA Reparatur durch die Bildung von Tripelhelices zu aktivieren. Als dritte Möglichkeit nennen sie small- fragment homlogures replacement.
All diese Ansätze haben den Vorteil, dass keine DNA zufällig ins Genom integriert und damit das Tumorrisiko erhöht, erfordern für in vivo Therapie aber immer noch virale Vektoren, oder?
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