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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878
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Verfasst am: 08. März 2013 15:59 Titel: Herstellung viraler Vektoren für Gentherapie |
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Hi,
bei der Herstellung viraler Vektoren für die Gentherapie werden immer Konstrukte hergestellt bei denen die Gene für die Verpackung und Replikation durch das intakte Gen, welches in die Zelle gebracht werden soll ersetzt sind. Das hat zur Folge, dass die Vektoren nicht mehr replizieren können.
Dieses therapeutische Konstrukt wird dann in Zellinien eingebracht, welche die für die Replikation und Verpackung benötigten Gene exprimieren. Diese Zellen produzieren dann virale Partikel, die nur für das Zielgen und die für die Integration benötigten Sequenzen (bei Lentiviren oder AAV) kodieren.
Diese Vektoren werden dann entweder dem Patienten verabreicht oder in vitro mit Zielzellen des Patienten zusammengebracht und infizieren diese.
AAV und Lentiviren sind Vektoren, die zur Integration des Zielgens führen könnten. Diese Option ist interessant für die Dauertherapie bei Erbkrankheiten, könnte aber auch je nach Integrationsort zur Tumorentstehung führen. AAV sind besonders interessant, da das Virus selbst nicht pathogen ist und auch Nervenzellen infizieren kann.
Adenoviren als Vektoren sind für verübergehende Expression eines Genes in der Tumortherapie interesant. Sie führen nicht zur Integration des Gens. Ein Problem der Adenoviren ist aber ihre hohe Immunogenität und die dadurch starke Immunreaktion auf den Vektor.
Stimmt das soweit?
LG und Danke
Firelion _________________ It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg
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Verfasst am: 09. März 2013 08:20 Titel: |
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Bei lentiviralen Vektoren ist das Problem, dass sich das Verpackungssignal in der Gag-ORF befindet, wodurch es immer mal zu Rekombinationen kommen kann, da sich die ORF nicht vollständig deletieren lässt. _________________ RNA?- just another nucleic acid? |
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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878
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Verfasst am: 09. März 2013 16:19 Titel: |
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Ah also ist bei Lentiviren die Befürchtung, da ein erneut Replikationsfähiges und pathogenes Virus zu bekommen?
Bei AAV ist das Problem, dass man nur kurze Gensequenzen in den Vektor klonieren kann und so größere Gene wie das Dystrophingen nicht mittels AAV in die Zellen eingebracht werden können, oder? _________________ It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg
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Verfasst am: 10. März 2013 14:31 Titel: |
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Firelion hat Folgendes geschrieben: | Ah also ist bei Lentiviren die Befürchtung, da ein erneut Replikationsfähiges und pathogenes Virus zu bekommen? |
Wenn ein entsprechendes Rekombinationsereignis vorliegt....
Firelion hat Folgendes geschrieben: | Bei AAV ist das Problem, dass man nur kurze Gensequenzen in den Vektor klonieren kann und so größere Gene wie das Dystrophingen nicht mittels AAV in die Zellen eingebracht werden können, oder? |
Wie gross Dystrophin jetzt ist, weiss ich nicht, aber ja: Die Kapazitäten sind vergleichsweise klein.
Nun muss man aber auch nicht unbedingt das Gen "ersetzen", wenn die pathologische Mutation z.B. in einem regulatorischen Bereich ist, kann man die Bindung des entsprechenden Faktors an diese Stelle inhibieren oder ersetzen. Damit kann man auch mit geringeren Kapazitäten hinkommen. _________________ RNA?- just another nucleic acid? |
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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878
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Verfasst am: 11. März 2013 17:32 Titel: |
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Du meinst im Sinne von:
Wir basteln uns einen " Ersatztranskriptionsfaktor) der den "kaputten" Promoter erkennt bzw. einen Repressor der diesen bindet um die Synthese pathogener Proteine (die z.B, inclusion bodies bilden) verhindern ? _________________ It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg
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Verfasst am: 11. März 2013 19:52 Titel: |
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Das wäre zumindest theoretisch auch eine Idee, aber daran habe ich nicht gedacht. Da ich v.a. auf RNA-Ebene arbeite, dachte ich eher daran, einen Faktor, der mRNA-Stabilität beeinflusst und nun durch eine Mutation eine gewisse Sequenz erkennt "auszutitrieren". Nehmen wir z.B. einmal an, eine Bindungsstelle für ein Protein, das eine mRNA destabilisiert, wird durch eine Punktmutation erzeugt. Wenn ich nun diese Bindungsstelle durch ein "harmloses" Protein "absättige", kann der regulatorische Faktor nicht mehr binden und die mRNA-Regulation kann hoffentlich wieder normalisisert werden. Dazu kann ich z.B. ein Ribonukleoprotein nehmen, was schon in der Zelle vorkommt und allein an der entsprechend mutierten Stelle keine Interaktionspartner findet (z.B. U6snRNP für einige 3'UTR-Mutationen). Was man dann mit dem Vektor einbringen könnte, wäre die RNA-Einheit dieses Ribonukleoproteins mit einer "Erkennungsdomäne", die an die mutierte Sequenz bindet (so kann man z.B. de novo entstandene miRNA-Bindungsstellen oder andere "austitrieren"). Auch Antisense-Oligonukleotide wären eine Option. _________________ RNA?- just another nucleic acid? |
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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878
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Verfasst am: 11. März 2013 20:03 Titel: |
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Ah letzteres finde ich eine attraktive Idee in der Tumortherapie zum "Wegfangen" von Onkogen- mRNA.
Was ja auch den vorteil hätte, das hier nicht unbedingt eine Integration in das Genom von Nöten wäre und damit die Gefahr durch die Therapie einen Tumor zu bekommen sinkt.
Das austritrieren erinnert mich gerade an die "Blocking"- Schritte bei Blots.
Also praktisch sowas wie ein in vivo Blocken nur nicht mit Milchpulver sondern mit einem einzigen Protein. _________________ It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg
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Verfasst am: 11. März 2013 20:16 Titel: |
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Firelion hat Folgendes geschrieben: | Das austritrieren erinnert mich gerade an die "Blocking"- Schritte bei Blots.
Also praktisch sowas wie ein in vivo Blocken nur nicht mit Milchpulver sondern mit einem einzigen Protein. |
Na ja, du brauchst das Gen für das Protein, das die mutierte Sequenz binden soll, ja gar nicht in dem Vektor kodiert zu haben. Du kannst ja auf eines zurückgreifen, das eine bestimmte RNA-Sequenz mittels RNA-RNA-Interaktion erkennt und bereits in Unmengen im Zellkern vorhanden ist. Was du dann mit dem Vektor einbrächtest, wäre eine kodierte RNA-Einheit dieses Ribonukleoproteins, dessen RNA-Erkennung nun nicht komplementär zu der Sequenz ist, die das Ribonukleoprotein normalerweise erkennt, sondern stattdessen komplementär zu der mutierten Sequenz ist und an diese bindet.
Der Vergleich mit dem Blot hinkt insofern, dass du die Membran zum einen auch hier mit einem einzigen Protein blockieren kannst (manchmal erzielt man mit BSA sogar bessere Ergebnisse als mit Milch) und dass du beim Blot unspezifische Bindungen der Antikörper vermeiden willst, die Blockierungs-Proteine binden also auch unspezifisch und unselektiv. Bei der Gentherapie der genannten Art willst du aber möglichst hochspezifisch arbeiten. _________________ RNA?- just another nucleic acid? |
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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878
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Verfasst am: 11. März 2013 20:53 Titel: |
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Ah also, wenn das Riboprotein dann daran bindet,wird die mRNA nicht mehr destabilisiert und eine höhere Expression wäre möglich.
Wenn man jetzt aber statt DNA RNA verwendet und einen langfristigen Effekt haben möchte, währen multiple Behandlungen nötig, da die RNA nicht ins Genom integriert (wenn man jetzt nicht Lentiviren verwenden wollte) , oder? _________________ It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg
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Verfasst am: 11. März 2013 21:36 Titel: |
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Also ich versuche so etwas ähnliches gerade mit Lentiviren für myeloide Zellen und mit AAV für Hepatozyten und ich hoffe doch sehr, dass das Gen für die nicht-codierende RNA integriert....
Du verwendest ja keine RNA, sondern ein Gen, das für eine nicht-codierende RNA codiert. _________________ RNA?- just another nucleic acid? |
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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009 Beiträge: 1878
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Verfasst am: 11. März 2013 21:46 Titel: |
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Ah. Dann integriert es hoffentlich nicht in Tumorsupressorgene oder Protoonkogene.
Anderseits wird ja auch bei der Krebstherapie in Kauf genommen, dass unter Umständen Jahre später ein neuer Tumor durch die Strahlentherapie entstehen kann, wenn dafür Lebensquantität und Lebensqualität gewonnen werden kann.
Ich finde die Technik gerade für die extrem seltenen Eerbkrankheiten interessant für die es keine Therapie bis jetzt gibt. _________________ It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
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Paulsi
Anmeldungsdatum: 27.01.2015 Beiträge: 1
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Verfasst am: 27. Jan 2015 11:27 Titel: |
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Bin gerade an einem Experiment mit Lentiviren für myeloide Zellen und wollte einen anderen Supplier ausprobieren weil wir mit unseren letzten LVs und AAVs ein paar Probleme hatten. Hat jemand schonmal bei Sirion Biotech http://www.sirion-biotech.com/page/Premade-LVs.html bestellt und kann mir da eine Rückmeldung zum Experimentverlauf geben?
LG |
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