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bella23
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BeitragVerfasst am: 19. Nov 2011 20:06    Titel: falsch positiv Antworten mit Zitat

Meine Frage:
hallo!
kannmir bitte jemand sagen was falsch positive interaktionspartner sind? die kann es wohl beim zwei-hybrid system geben...

Meine Ideen:
danke schon mal
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
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BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 00:40    Titel: Antworten mit Zitat

Das heisst, dass Proteine, die eigentlich nicht miteinander interagieren im Hefe-zwei-Hybridsystem es doch tun, da die Hefe etwas andere Proteinmodifikationen vornimmt, als es andere Eukartyonten tun. Durch z.B. veränderte Faltung oder andere Modifikationen anderer Aminosäuren des Proteins können so Interaktionen, die eigentlich nicht bestehen, vorgetäuscht werden.
Das geht auch andersherum, also durch eben die gleichen Gründe Proteine, die eigentlich miteinander interagieren, dieses im Hefesystem nicht tun. Das heisst dann falsch-negativ.

_________________
RNA?- just another nucleic acid?
bella23
Gast





BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 10:45    Titel: Antworten mit Zitat

oh gut das leuchtet mir ein. und weißt du auch wie man falsch positive interaktionspartner von echten interaktionspartner unterschiedet in so einem zwei-hybrid-system?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 10:55    Titel: Antworten mit Zitat

In dem System geht das nicht. Doch du kannst dann z.B. Colokalisationen der Proteine mit Co-Immunopräzipitationsessays zeigen.
Du musst dann aber in das System gehen, aus dem die Proteine ursprünglich kommen.

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RNA?- just another nucleic acid?
bella23
Gast





BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 11:03    Titel: Antworten mit Zitat

aber wieso geht das denn nicht?...mir wurde nämlich gesagt dass das funktioniert und ich soll mich jetzt nämlich darüber informieren wie das funktioniert, nur man findet irgendwie nichts darüber.
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 11:34    Titel: Antworten mit Zitat

Wie gesagt, es geht auch, aber eben nicht mehr im Hefe-zwei-Hybrid-System (ich hätte zumindest keine Ahnung, nicht einmal eine vage Idee, wie das gehen sollte).
Das Hefesystem ist ein screening-Verfahren, welche möglichen Interaktionspartner existieren, es gibt jedoch keine Auskunft über tatsächliche Interaktionen. Um das herauszufinden, musst du das System wechseln.

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bella23
Gast





BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 11:39    Titel: Antworten mit Zitat

und wie würde es funktionieren wenn es nicht das hefe-zwei-hybrid-system wäre? und was bedeutet screening-verfahren?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 11:49    Titel: Antworten mit Zitat

Wie gesagt, durch z.B. Co-Immunopräzipitation in dem System, aus dem die Proteine ursprünglich kommen.
Oder eine ganz interessante, mir jedoch auch nicht vertraute Technik ist der Förster-Resonanzenergietransfer.

"Screening" bedeutet ein gerichtetes Suchverfahren, also quasi ein "Siebtest". Man sucht also aus einer grossen Anzahl von Prüfobjekten (hier Proteine) diejenigen heraus, die die gesuchte Eigenschaft aufweisen (hier Interaktion mit einem anderen Protein). In diesem Fall "screent" man also verschiedene Proteine hinsichtlich ihrer Interaktion mit einem anderen Protein.

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bella23
Gast





BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 12:27    Titel: Antworten mit Zitat

und kennst du dich zufällig mit dem mating-verfahren aus im zusammenhang mit dem zwei-hybrid-screen? im internet und in büchern findet man irgendwie nichts dazu. wie funktioniert das und wo liegt deren wichtige bedeutung?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 12:52    Titel: Antworten mit Zitat

Meinst du "single-mating"?

Damit werden für ein bestimmtes Protein Interaktionspartner gesucht.

Ein anderes Verfahren wäre das "prey"-Verfahren, in dem aus einer cDNA-Bank mögliche Interaktionspartner gesucht werden.

Die Fragestellung beim "single-mating": Welche Proteine interagieren mit dem Protein, das ich untersuche? Ein Protein ist also immer das gleiche.
Die Fragestellung beim "prey"-Verfaheren: Welche Proteine aus meiner Datenbank interagieren miteinander? Es werden verschiedene Kombinationen getestet.

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bella23
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BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 12:56    Titel: Antworten mit Zitat

also es ist nur die rede vom mating-verfahren. ich dachte da gibt es nur eins? und wie genau funktioniert das?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 12:58    Titel: Antworten mit Zitat

Erkläre dazu doch einmal das Hefe-zwei-Hybrid-Verfahren.
Also, wie wird das technisch gemacht, dass man Proteininteraktionen damit untersuchen kann?

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bella23
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BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 13:09    Titel: Antworten mit Zitat

Ok also:
man bezieht sich ja z.B. auf transkriptionsfaktoren. diese bestehen ja auch einer dna-bindedomäne (DBD) und einer aktivierungsdomäne (AD). diese befinden sich normalerweise auf einem protein, können aber auch isoliert voneinander exprimiert werden (dabei behalten sie aber ihre jeweiligen funktionen). aber getrennt können sie keinen funktionsfähigen TF bilden da ja immer eine der beiden domänen fehlt. wenn man aber die beiden domänen mittels zweier unterschiedicher proteine zusammenbringt, entsteht wieder ein vollständiger TF und die Gene können transkribiert werden. hierzu stellt man zwei fusionproteine her. das eine setzt sich aus protein x und DBD zusammen und das andere aus Protein Y und AD. diese fusionproteine müssen in hefe transformiert werden. dazu nutzt man zwei plasmide (bait und prey-plasmid), die jeweils die entsprechenden gene kodieren. diese beiden plasmide werden dann in eine hefezelle transformiert und dort exprimiert. wenn beide fusionsproteine miteinander agieren entsteht ein funktionsfähiger TF und die transkription und damit expression der Reportergene (His3, lacZ) kann stattfinden.
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 13:24    Titel: Antworten mit Zitat

Thumbs up!

O.k, nun kann ich einmal in meinem screening das Köderprotein immer das gleiche sein lassen und das Beuteprotein variieren, dann sehe ich, welche Proteine aus meiner Auswahl mit dem untersuchten als Köderprotein eingesetzten Protein interagieren (single-mating).

Oder ich kann sowohl Beute- als auch Köderprotein variieren und in beliebigen Kombinationen ausprobieren. Dann sehe ich, welche Proteine aus meiner Auswahl miteinander interagieren (prey-Verfahren).

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bella23
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BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 13:33    Titel: Antworten mit Zitat

ich hab grad nochmal das internet durchstöbert und das hier zum mating gefungen:

"Beim sogenannten „Mating“ macht man sich die Tatsache zunutze, dass haploide Hefezellen
als zwei verschiedene Paarungstypen vorliegen können (Mat-α und Mat-a). Diese beiden
Paarungstypen können unter entsprechenden Bedingungen zu einer diploiden Zygote verschmelzen,
die ihrerseits wieder diploide Tochterzellen produziert. Wenn die beiden
Paarungstypen Träger unterschiedlicher Plasmide sind, enthält die diploide Zygote nach der
Verschmelzung auch beide Plasmide der Ausgangszellen."

und was ist das jetzt? noch ein anderes mating-verfahren?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 14:43    Titel: Antworten mit Zitat

bella23 hat Folgendes geschrieben:
i
und was ist das jetzt? noch ein anderes mating-verfahren?


Klingt so....

Ich würde sagen, dass man da die beiden Plasmide jeweils in einen der beiden Paarungstypen transfiziert und sie dann die Paarung vollziehen lässt.
Die Tochterzelle hat dann wohl beide Plasmide und in dieser finden dann auch die Untersuchungen statt.
Ich weiss aber nicht, warum man das so macht.
Wäre aber auch für mich interessant zu wissen. Hast du dazu was gefunden?
Ich könnte mir vorstellen, dass man damit Selbstaktivatoren untersucht, die aber auch mit anderen Proteinen interagieren.
In einen Typen transfiziert man dann zwei Plasmide und schaut sich die Interaktion eines Proteins mit sich selber an. Potentielle andere Interaktionspartner werden dann in den anderen typen transfiziert und nach Paarung wird dann diese untersucht.
Den Unterschied könnte man sich dann vielleicht anschauen, indem man mit dem Transkriptionsfaktor ein GFP- oder Luciferase-Gen antreibt und anhand der veränderten Lumineszens oder Fluoreszens dann sagen, ob neben der Selbstaktivierung dann auch eine Interaktion mit dem anderen Protein besteht.
Ist wie gesagt aber nur eine spontane Idee, wirklich wissen tue ich das nicht.

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bella23
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BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 16:52    Titel: Antworten mit Zitat

also ich hab dazu auch nichts anderes gefunden als das bereits beschriebene...
ich hab hier noch eine aufgabe die ich lösen muss...vllt. kannst du mir ja dabei helfen Augenzwinkern
und zwar soll ich mindestens ein weiteres unternehmen (clonetech hab ich schon) , das ebenfalls ein Kit für Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen anbietet finden. Weißt du da zufällig eins? und was ist ein Kit?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 17:03    Titel: Antworten mit Zitat

Ein Kit ist eine durch eine Firma bereitgestellte Zusammensetzung von Reagenzien für ein bestimmtes Experiment. Da ist dann alles drin, was du brauchst, um deine Versuche durchzuführen.
Kit heisst übersetzt soviel wie Baukasten oder Gesamtausstattung.

Weitere Firmen für das System wären z.B. Invitrogen oder DualsystemsBiotech.

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bella23
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BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 17:16    Titel: Antworten mit Zitat

und wann würdest du z.B. bevorzugt clonetech nehmen und wann invitrogen? und warum?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 17:30    Titel: Antworten mit Zitat

Ich habe damit noch gar nicht gearbeitet, aber in dem Labor, in dem ich mal war, wurde mit dem Clonetec-System gearbeitet.
Welches bevorzugt wird, hängt davon ab, welcher Vertreter die besseren Angebote macht. Zwinkern

Ich weiss nicht, wie die sich unterscheiden und welches das zuverlässsigere ist.

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bella23
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BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 17:38    Titel: Antworten mit Zitat

ok...smile dann hätte ich da noch eine letzt frage zum split-ubiquitin-verfahren. was sind denn die entscheidenden komponenten des verfahrens und wie unterscheidet sich das vom zwei-hybrid-system? und wann würde man eher das eine und wann das ander einsetzen? und könntest du mir vllt auch erklären wie das split-ubiquitin-verfahren funktioniert?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 17:54    Titel: Antworten mit Zitat

Schau mal dort nach, da ist das eigentlich ganz gut beschrieben, mitsamt den Unterschieden und Vorteilen zum Hefesystem:

http://www.biospektrum.de/blatt/d_bs_pdf&_id=933306

Und wenn du dazu Fragen hast, meld dich einfach nochmal.

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bella23
Gast





BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 19:21    Titel: Antworten mit Zitat

und was ist damit gemeint:
Die split-Ub-Methode unterscheidet
sich vom Two-Hybrid-System, indem sie die
Untersuchung von Proteininteraktionen an
den Orten erlaubt, an denen die Interaktionen
der unmodifizierten Proteine in der
Zelle stattfinden.

beim zwei-hybrid-system ist das nicht so? wieso?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 20. Nov 2011 19:38    Titel: Antworten mit Zitat

bella23 hat Folgendes geschrieben:

beim zwei-hybrid-system ist das nicht so? wieso?


Na ja, beim hefesystem transformierst du die Plasmide, die Sequenzen enthalten, dessen Produkte in anderen Organismen vorkommen, in Hefezellen. Der authentische Ort der Interaktion ist aber z.B. eine menschliche Zelle (wenn du humane Proteine untersuchst).
Das Split-Ubiquitin-System führst du dann z.B. auch in menschlichen Zellen durch.

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bella23
Gast





BeitragVerfasst am: 22. Nov 2011 14:25    Titel: Antworten mit Zitat

hi ich bins nochmal
und zwar zum mating-verfahren: ich hab doch noch folgendes gefunden:
Mating-Protokoll:
- Transformation eines Hefestammes des Mating-Typs MATa (z. B. Y190) mit dem Köder-
Plasmid
- Transformation eines Hefestammes des Mating-Typs MATα (z. B. Y187) mit einem oder
mehreren Plasmiden, die auf die Wechselwirkung mit dem Köder-Plasmid hin untersucht werden sollen

nur ob ich das auch richtig verstandne habe:wenn da steht transformation in einen hefestamm mit dem köderplasmid, dann heißt das doch dass nur jeweils ein köder-plasmid in jede hefezelle des hefestammes transformiert wird oder?
und beim nächsten stichpunkt ebenso. ist es hier dann richtig dass auch mehrer plasmide gleichzeitig in eine hefezelle eingebracht werden können? aber wie weißt man dann nach welche proteine davon miteinanderagieren?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 22. Nov 2011 17:38    Titel: Antworten mit Zitat

Natürlich nur ein Köderplasmid.
Und in den anderen Typen transformierst du auch jeweils nur ein Plasmid, denn wie du richtigerweise angemerkt hast, ist sonst der definitive Interaktionspartner nicht zu identifizieren.

_________________
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bella23
Gast





BeitragVerfasst am: 22. Nov 2011 17:45    Titel: Antworten mit Zitat

ok... und du hattest ja erwähnt dass man mittels koimmunpräzipitation die Protein-protein-interaktion nochmal überprüfen kann. wie genau funktioniert die koimmunpräzipitation? hab auch schon das internet durchforstet aber so richtig versteh ich nicht wie das gehen soll...
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 22. Nov 2011 18:15    Titel: Antworten mit Zitat

Hast du den Wikipedia-Artikel dazu schon gelesen?

http://de.wikipedia.org/wiki/Immunpr%C3%A4zipitation

In Kürze:
Du "fischt" aus einem Proteinlysat mit Antikörpern das "gesuchte" Protein heraus, an dem dann auch (hoffentlich) der Interaktionspartner gebunden ist. Dann weist du die Proteine in einem Immunoblot (Western-Blot) nach.

Lies dir auch mal den Wiki-Artikel durch und meld dich gerne, wenn du dazu Fragen hast.

Was ein Western-Blot ist, weisst du?

_________________
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