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Nachricht |
JMH
Anmeldungsdatum: 09.07.2012
Beiträge: 1
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 Verfasst am: 09. Jul 2012 14:41 Titel: Ligation von Vektor und Insert-DNA |
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Ich schreibe diese Woche Mikrobiologie-Prüfung und als Vorbereitung haben wir einige Fragen bekommen. Zu dieser weiß ich allerdings partout keine Antwort :
"Welche Produkte entstehen theoretisch bei einer Ligation von Vektor und Insert-DNA, wenn nur 1 Restriktionsenzym verwendet wurde?
Vielleicht kann mir da jemand weiterhelfen?
LG Julia |
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Firelion
Anmeldungsdatum: 27.08.2009
Beiträge: 1878
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| Verfasst am: 09. Jul 2012 17:11 Titel: |
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Hi,
hmm wenn man zum Schneiden des Vektors und des Inserts nur ein Restriktionsenzyme und zwar das gleiche (?) verwendet hst und nicht eines von beiden dephosphoryliert, würde ich vermuten:
1: Insert in Plasmid
2. Autoligation Plasmid
3: Autoligation Insert
Das könnte passieren, weil die Schnittenden an beiden Enden kompatibel sind.
Sicher bin ich mir da aber nicht.
LG Firelion
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It is well known that a vital ingredient of success is not knowing that what you’re attempting can’t be done - Terry Pratchett |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 10. Jul 2012 20:22 Titel: |
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Man sollte noch ergänzen, dass die Insertionsrichtung nicht festgelegt ist, das Insert also in beiden Orientierungen eingefügt werden kann.
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RNA?- just another nucleic acid? |
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PaGe
Moderator
Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3549
Wohnort: Hannover
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| Verfasst am: 13. Jul 2012 17:55 Titel: |
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Das gilt nur, wenn es eine palidrome Sequenz ist, was allerdings häufig der Fall ist.
Des Weiteren wäre Plasmid-Plasmid-Ligation auch denkbar, allerdings von sehr untergeordneter Rolle.
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Die deutsche Rechtschreibung ist Freeware, du darfst sie kostenlos nutzen. Aber sie ist nicht Open Source, d. h., du darfst sie nicht verändern oder in veränderter Form veröffentlichen. |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 14. Jul 2012 16:04 Titel: |
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| PaGe hat Folgendes geschrieben: | | Das gilt nur, wenn es eine palidrome Sequenz ist [...] |
Wer kloniert denn schon mit diesen "Exoten", bei denen die (auch meist palindrome) Erkennungssequenz die tatsächliche Schnittstelle mehr oder weniger weitläufig flankiert? 
Ausserdem ist bei solchen Klonierungen unter Umständen gar keine sticky-Ligation möglich, da die Enden der zu ligierenden Fragmente womöglich nicht mal degeneriert komplementär zueinader sind.
Auch alle anderen Möglichkeiten kommen nur bei palindromen Schnittstellen in Frage oder bei solchen, wo die Schnittstelle des Inserts die gleichen Überhänge bildet wie im Rückrat. Ist das der Fall, so muss ja -vorausgesetzt das Enzym schneidet in dem Rückrat nur an einer Stelle- auch die Insertion an beiden "Seiten" die passenden Überhänge bilden, womit dann auch eine reverse Ausrichtung wieder möglich wäre.
| PaGe hat Folgendes geschrieben: | | Des Weiteren wäre Plasmid-Plasmid-Ligation auch denkbar, allerdings von sehr untergeordneter Rolle. |
Theoretisch möglich, doch ich habe das trotz mehrerer hundert Klonierungen noch nie erlebt.
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RNA?- just another nucleic acid? |
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PaGe
Moderator
Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3549
Wohnort: Hannover
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| Verfasst am: 14. Jul 2012 20:39 Titel: |
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 Bin gerade geistig nicht auf der Höhe. Wie soll ich das verstehen? Kloniert man nur noch blunt? Was ist mit der ganzen Linker-Verknüpfung?
Nur weil du die Plasmid-Plasmid-Variante nicht im Gel siehst, heißt das doch nicht, dass es sie nicht gibt. Allerdings dürfte der Anteil wirklich deutlich unter 1 Promille liegen.
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 14. Jul 2012 20:57 Titel: |
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| PaGe hat Folgendes geschrieben: | | Kloniert man nur noch blunt? |
Nö, das meinte ich nicht.
Ich bezog mich auf Restriktionsenzyme, wo zwischen der (palindromen) Erkennungssequenz eine unbestimmte Sequenz liegt, in der sich die Schnittstelle befindet (also z.B. ALWNI: CAGNNN/CTG; der slash bezeichnet die Schnittstelle). Den Überhang bilden hier drei unbestimmte Nukleotide (NNN).
Auf was für Enzyme bezogst du dich denn, als du andeutetest, dass die Sequenzen nicht immer palindrom sein müssen?
| PaGe hat Folgendes geschrieben: | | Nur weil du die Plasmid-Plasmid-Variante nicht im Gel siehst, heißt das doch nicht, dass es sie nicht gibt. Allerdings dürfte der Anteil wirklich deutlich unter 1 Promille liegen. |
In einem asymmetrischen Kontrollverdau sähe ich an dem charakteristischen Bandenmuster eine solche Variante.
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PaGe
Moderator
Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3549
Wohnort: Hannover
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| Verfasst am: 14. Jul 2012 21:29 Titel: |
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Kein konkretes Enzym. Ich wusste nur, dass es auch Restriktionsenzyme gibt, die kein Palindrom haben. Daher habe ich das ganz allgemein eingeworfen. Ich habe vor 7 Jahren das letzte Mal im Labor kloniert ^^.
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 15. Jul 2012 15:35 Titel: |
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Geben tut es die schon, z.B. Typ I oder Typ III- Restriktionsendonukleasen oder Zinkfingernukleasen. Ausser Zinkfingernukleasen sind die aber für die Molekularbiologie völlig uninteressant, da nicht einmal die Entfernung der Schnittstelle von der Erkennungssequenz eindeutig bestimmt werden kann.
Umgangssprachlich und (soviel ich weiss) auch in der Schule werden aber als Restriktionsenzyme stets Typ II- Restriktionsendonukleasen bezeichnet. Zinkfingernukleasen (eigentlich ja auch Restriktionsenzyme) werden gesondert bezeichnet und die Typen I und III werden eigentlich gar nicht theamtisiert. Zum Klonieren sind diese alle aber ungeeignet, weswegen ich stillschweigend davon ausgegangen bin, dass es sich natürlich um Typ II- RE handeln muss.
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