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Delija
Anmeldungsdatum: 10.01.2008
Beiträge: 7
Wohnort: Frankfurt
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 Verfasst am: 09. Jun 2010 11:42 Titel: Gentechnik: Phagen als Vektor |
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Hallo,
Ich brauche mal eure Hilfe bei der Gentechnik...
Ich dachte mal, ich hätte es verstanden aber wenn ich mir meine Mitschriften angucke finde ich das nur noch wiedersprüchlich.
Wenn ich einen Phagen als Vektor habe will ich doch Bakterien gentechnisch verändern, oder? Wahrscheinlich ne blöde Frage...
Ich hab das dann schrittweise aufgeschrieben was zu tun ist.
1) Ich muss die Phagen-DNA isolieren und mein Fremdgen einbauen (logisch)
2) Die Phagen-DNA muss nun in einen Phagenvektor eingebaut werden. Ich hab mir aufgeschrieben, dass ich das Phagen-Capsid aus Bakterien bekomme. OK, im Prizip auch noch logisch.
3) Jetzt die Infektion von Bakterien, der lytische Zyklus soll eingeschlagen werden. Das versteh ich jetzt nicht... Wieso denn der lytische Zyklus? Ich will die Bakterien doch nicht zerstören, sondern verändern, da ist es meiner Meinung nach ganz logisch, dass ich als Ziel den lysogenen Zyklus haben will, wo das Phagen-Genom in mein Bakterium eingebaut wird... und dann wäre ich im Prinzip schon fertig...
Aber gut, es soll mit dem lytischen Zyklus passieren, warum auch immer. Dann kommt der nächste Schritt.
4) Wie man die rekombinierten Phagen erkennt. Mir ist klar, dass ich die selektieren muss und ich verstehe auch wie man das macht, allerdings fände ich es logischer, wenn man erst die Phagen isoliert und dann die Bakterien infiziert...
5) Isolation der Phagen
Hä, welche Phagen will ich denn jetzt noch isolieren??? Wahrscheinlich die Phagen aus Schritt 4 trennen von den zerstörten Zellen... (ich hab das zwar noch nie im Labor gemacht, aber ist das nicht reine Zeitverschwendung?
Das war der letzte Schritt, aber wo sind jetzt meine fertigen Bakterien mit dem Fremd-Gen? Außer zerstörten Bakterien und isolierten Phagen hab ich ja nichts gewonnen, was bringt mir das? Zerstörte Bakterien können mein Fremdgen ja nicht ablesen... oder soll das irgendwie der Phagen tun??? Glaub ich ja nicht, eine Bakterienkultur ist sicher viel leichter...
OK, und selbst wenn mir jetzt jemand erklären kann, dass es doch einen Sinn ergibt, frage ich mich, wofür ich so viel Arbeit auf mich nehmen soll wenn es vergleichsweise ganz leicht geht, ein Bakterium mit Plasmid und Elektoporation zu verändern.
Vielen Dank für eure Antworten! |
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Jamaar
Gast
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| Verfasst am: 10. Jun 2010 08:07 Titel: |
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Hey! Ich hoffe ich kann dir ein bisschen helfen :-)
Es gibt 2 mögliche arten wie ich phagen-dna einschläuse, nämlich im lytischen (bsp.: t7-phage) oder im lysogenen (bsp.: lambda-phage) zyklus.
der unterschied liegt darin, dass im lysogenen zyklus die phagen-dna in die wirts-dna eingebaut und somit teil des genoms wird.
beim lytischen zyklus liegt die dna als plasmid vor. das sind zyklische dna-stücke, die unabhängig vom genom repliziert und transkripiert wird.
du hast recht, in der natur würde dadurch dann die zelle zerstört werden, aber die bei den vektoren werden die gene entfernt (restriktionsenzyme), die für die vermehrung der phage (hüllenprotein, enzyme...). desshalb wird die zelle hierbei nicht lysiert.
bei lysogenen phagen kommt es, nach induktion durch bsp. giftstoffe oder uv-licht, zum übergang vom lysogenen zyklus in den lytischen. schließlich wollen die sich ja auch mal vermehren :-).
es geht darum, dass man die bakterien isoliert, die den vektor in sich tragen. es gibt verschiedene methoden, wie man vektoren in die zelle rein bekommt, jedoch sind die alle bei weitem nicht zu 100 % effektiv. desshalb versetzt man das plasmid mit einem markergen (bsp. antibiotikaresistenz). dann können nur noch bakterien wachsen, die dieses resistenzgen wachsen. würde man das nicht tun, dann hätte man sehr viel mehr bakterien ohne als mit plasmid im medium. dies liegt daran, da sie ohne plasmid (und daraus resultierenden höheren stress durch replikation des plasmids) viel schneller wachsen als mit.
ich hoffe ich habe die frage richtig verstanden, bin mir da nicht so ganz sicher :-)
dies wäre erklärung für 4 und 5. denn das plasmid (phage ist es eigentlich nicht mehr, da man ja nur mit teilen seiner dna verwendet) wird durch das markergen isoliert. denn durch die antibiotikaresistenz vermehren sich nur noch bakterien mit dem korrekten plasmid (auch dies funktioniert nicht zu 100%) aber plasmide ohne diesem gen bewirken ja ohnehin keinen vorteil.
hoffe ich konnte helen :-) |
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Delija
Anmeldungsdatum: 10.01.2008
Beiträge: 7
Wohnort: Frankfurt
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| Verfasst am: 12. Jun 2010 12:39 Titel: |
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Danke für die Antwort.
Mhm... ne, ich glaube du hast mich nicht richtig verstanden.
Das was du geschrieben hast wusste ich eigentlich auch schon vorher, aber trotzdem danke für die Mühe!
| Zitat: | beim lytischen zyklus liegt die dna als plasmid vor. das sind zyklische dna-stücke, die unabhängig vom genom repliziert und transkripiert wird.
du hast recht, in der natur würde dadurch dann die zelle zerstört werden, aber die bei den vektoren werden die gene entfernt (restriktionsenzyme), die für die vermehrung der phage (hüllenprotein, enzyme...). desshalb wird die zelle hierbei nicht lysiert.
bei lysogenen phagen kommt es, nach induktion durch bsp. giftstoffe oder uv-licht, zum übergang vom lysogenen zyklus in den lytischen. schließlich wollen die sich ja auch mal vermehren :-). |
Aber laut meinem Text wird ja der lytische Zyklus angestrebt und im Schritt 6 habe ich ja dann zerstörte Bakterien... Die können ja dann eigentlich nur von Schritt 4 sein, demnach muss dort doch der ganz normale lytische Zyklus gewesen sein (also ohne dass vorher die Gene entfernt wurden).
Aber ich hab mir überlegt, dass eventuell erst die Phagen vermehrt werden müssen und das passiert dann wahrscheinlich bei Schritt 4, logischerweise über den (normalen) lytischen Zyklus.
Dann kann ich bei Schritt 5 und 6 die Phagen isolieren, die das Fremdgen aufgenommen haben und dann beim letzten Schritt (der nicht dabei steht) schließlich die Bakterien infizieren und diesmal dann mit dem lysogenen Zyklus.
Wär das richtig?
Und sollte ich vorher noch aus dem Phagen die Gene rausschneiden, die dafür sorgen, dass irgendwann doch noch der lytische Zyklus eingeschlagen wird (will ich ja nicht)?
| Zitat: | | es geht darum, dass man die bakterien isoliert, die den vektor in sich tragen. es gibt verschiedene methoden, wie man vektoren in die zelle rein bekommt, jedoch sind die alle bei weitem nicht zu 100 % effektiv. desshalb versetzt man das plasmid mit einem markergen (bsp. antibiotikaresistenz). dann können nur noch bakterien wachsen, die dieses resistenzgen wachsen. würde man das nicht tun, dann hätte man sehr viel mehr bakterien ohne als mit plasmid im medium. dies liegt daran, da sie ohne plasmid (und daraus resultierenden höheren stress durch replikation des plasmids) viel schneller wachsen als mit. |
Stimmt im Prinzip. Bei Schritt 5 jedoch geht es darum, erst mal die Phagen zu isolieren. Das geschieht mit der Größe des Genoms  . |
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Jaamar
Gast
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| Verfasst am: 13. Jun 2010 09:15 Titel: |
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| Delija hat Folgendes geschrieben: | Danke für die Antwort.
Aber laut meinem Text wird ja der lytische Zyklus angestrebt und im Schritt 6 habe ich ja dann zerstörte Bakterien... Die können ja dann eigentlich nur von Schritt 4 sein, demnach muss dort doch der ganz normale lytische Zyklus gewesen sein (also ohne dass vorher die Gene entfernt wurden).
Aber ich hab mir überlegt, dass eventuell erst die Phagen vermehrt werden müssen und das passiert dann wahrscheinlich bei Schritt 4, logischerweise über den (normalen) lytischen Zyklus.
Dann kann ich bei Schritt 5 und 6 die Phagen isolieren, die das Fremdgen aufgenommen haben und dann beim letzten Schritt (der nicht dabei steht) schließlich die Bakterien infizieren und diesmal dann mit dem lysogenen Zyklus.
Wär das richtig?
Und sollte ich vorher noch aus dem Phagen die Gene rausschneiden, die dafür sorgen, dass irgendwann doch noch der lytische Zyklus eingeschlagen wird (will ich ja nicht)? |
naja, wenn ihr ein rekombinantes protein produziert habt, dann ist es unpraktisch einen vollständig funktionsfähigen phagen zu verwenden. denn wenn dieser vermehrt wird und nicht nur das gewünschte protein, dann ist die ausbeute nicht gerade berauschend. die bakterien werden sich nach der infektion auch nicht mehr wirklich gut vermehren.
ich weiß ehrlich gesagt nicht, ob man so einfach zwischen lytischen und lysogenen zyklus switchen kann. was habt ihr dnen für eine phage verwendet? wenn es zb. die t7-phage ist,d ann kann die nämlich gar nicht im lysogenen zyklus vorliegen. die lambda-phage kann dies jedoch schon.
bei uns im labor war das so, wir haben einen pet-vektor (von der T7-Phage) mittels elektroporation in den wirtsorganismus (e.coli) eingebracht und dann ein gfp-protein expressioniert.
kann es sein, dass ihr die bakterien mittel ultraschall oder reagenzien aufgebrochen habt?
| Delija hat Folgendes geschrieben: | | Stimmt im Prinzip. Bei Schritt 5 jedoch geht es darum, erst mal die Phagen zu isolieren. Das geschieht mit der Größe des Genoms . |
das habt ihr vermutlich mit elektrophorese gemacht, oder? habt ihr dabei das bakteriengenom oder die phagendna untersucht? |
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