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Nachricht |
rosa_limo
Gast
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 Verfasst am: 07. Sep 2013 01:58 Titel: unbekanntes Gen amplifizieren? PCR |
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Hey,
ich habe folgende Frage:
Ist es möglich ein vollkommen unbekanntes Gen mittels PCR zu amplifizieren?
Gibt es denn dabei ein Problem, wenn das Gen unbekannt ist? Ich meine zum Verfielfältigen braucht man doch die Taq-Polymerase,den Vorwärts-/ Rückwärts-Primer, die Nucleaotidbasen, Mg2+-Ionen und eine Pufferlösung.
Und wenn man genug von den Nucleotiden in das Reaktionsgemisch gibt, dann sollte das doch kein Problem sein, oder? |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 07. Sep 2013 10:18 Titel: Re: unbekanntes Gen amplifizieren? PCR |
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| rosa_limo hat Folgendes geschrieben: | | Und wenn man genug von den Nucleotiden in das Reaktionsgemisch gibt, dann sollte das doch kein Problem sein, oder? |
Das ist nicht der Punkt.
Das Problem wäre hier eher das Primer-Design. Die Primer müssen ja spezifisch sein, d.h. sie müssen an eine definierte Zielsequenz mit hoher Genauigkeit binden und diese Zielsequenz sollte dein Gen flankieren. Wenn nun die Nukleotidsequenz unbekannt ist, könnte das schon ein Problem sein. Es gibt hier verschiedene Möglichkeiten, doch dazu müsste zunächst bekannt sein, ob denn wenigstens einige Sequenzabschnitte innerhalb des Gens bekannt sind, dann könntest du mit einer sog. inversen PCR erstmal die komplette Sequenz des Gens ermitteln. Wenn die Aminosäuresequenz des Gens bekannt ist, könntest du mit degenerierten Primern versuchen, zumindest das offene Leseraster (ORF) zu amplifizieren oder von dem 3'-Ende der ORF in die 3'UTR bzw. von dem 5'-Ende in die 5'UTR zu Sequenzieren. Sind die Sequenzen bekannt, die das Gen flankieren, kannst du hier deine Primer binden lassen. Handelt es sich um ein unbekanntes Gen, das auf einem Chromosom liegt, welches auch keine bekannten Sequenzen aufweist, müsstest du es zerstückeln, die Stücke mit Adaptorsequenzen flankieren, dann über Primer, die an die Adaptoren binden, sequenzieren und bioinformatisch zusammenbasteln. Wenn die bekannten Sequenzen weit weg von dem Gen sind, könntest du dich dem Gen Stück für Stück nähern, indem du von einer Bekannten Sequenz in die unbekannte hineinsequenzierst, dann einen Primer in der erhaltenen Sequenz binden lässt und mit diesem wieder weiter in die unbekannte Sequenz fortschreitest. Dazu müsste allerdings zumindest die ungefähre Position des Gens bekannt sein.
Das waren nur einige Beispiele, die verdeutlichen sollen, dass die Information "unbekanntes Gen" nicht ausreicht. Um hier konkret zu helfen, müsste man schon wissen, was über das Gen denn bekannt ist: chromosomaler Kontext? ungefähre Position? Aminosäuresequenz des Genproduktes? umgebende Sequenzen? kleinere Sequenzabschnitte innerhalb des Gens? usw...
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RNA?- just another nucleic acid? |
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rosa_limo
Gast
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| Verfasst am: 07. Sep 2013 19:57 Titel: |
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Hey,
danke für deine Antwort. In meiner Aufgabenstellung heißt es ja: Ein völlig unbekanntes Gen, also können ja Sequenzabschnitte innerhalb des Gens nicht bekannt sein. Also muss der Bereich in der Nähe bekannt sein, damit man den passenden Primer nutzen kann. |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 08. Sep 2013 14:14 Titel: |
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Ist das die vollständige Aufgabe oder gibt es da noch mehr Informationen? Ansonsten ist die Aufgabe schwer zu beantworten. Prinzipiell möglich ist es, ja, aber die Strategie des Vorgehens hängt doch sehr davon ab, was man weiss. Wenn man gar nichts weiss, muss man halt Sequenzieren, bioinformatisch zusammenbasteln und hinterher ORFs suchen. Das allerdings kann durchaus Monate bis Jahre dauern und hätte dann fast die Dimension des human genome projekt (etwas übertrieben ausgedrückt).
Aber auch der Begriff "unbekanntes Gen" sagt nicht unbedingt aus, dass die Sequenz unbekannt ist, es kann auch sein, dass die Sequenz erfasst, jedoch nicht als Gen datiert ist. Das humane Genom z.B. ist in seiner Sequenz durchaus nahezu vollständig bekannt, da heisst aber noch lange nicht, dass auch alle Gene bekannt und datiert sind. Wenn das die vollständige Aufgabenstellung ist, kann man meiner Meinung nicht mehr sagen, als dass es prinzipiell möglich ist, jedoch sehr wahrscheinlich nicht mit einer "Sandard"-PCR.
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RNA?- just another nucleic acid? |
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