RegistrierenRegistrieren    LoginLogin   FAQFAQ    SuchenSuchen   
Wie findet man den Primer bei PCR ?
 
Neue Frage »
Antworten »
    Foren-Übersicht -> Genetik
Autor Nachricht
prisma
Gast





BeitragVerfasst am: 30. März 2012 17:13    Titel: Wie findet man den Primer bei PCR ? Antworten mit Zitat

Meine Frage:
Hallo,

ich hätte da mal eine Frage, wie findet man eigentlich den Primer für die PCR heraus. Man muss ja aufpassen, das die Primer an unterschiedlichen Stellen des Einzelstranges anheften und das Polymerasen eine freie 3'OH Gruppe benötigen um das nächste Nucleotid anzuhängen.

Vielen Dank im voraus

prisma

Meine Ideen:
Also ich weiß ,dass sie die komplementären Basenpaare sind aber ich verstehe es nicht, was es mit den 2 anderen bedingungen auf sich hat wäre nett wenn ihr mir ein Beispiel gibt und eine Lösung, damit ich das endlich verstehe. Nochmals Danke
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2109
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 31. März 2012 09:19    Titel: Antworten mit Zitat

Primerdesign ist oft gar nicht trivial, da gibt es -abhängig davon, zu welchem Zweck man die PCR einsetzen möchte- einiges zu berücksichtigen.
Doch das Prinzip ist immer das gleiche, du nutzt sie als "Startmoleküle", um dann mittels einer PCR gezielt eine bestimmte Sequenz zu vervielfältigen.
Nehmen wir einmal an, du hast einen zu amplifizierenden Doppelstrang, der von folgenden Sequenzen flankiert wird:

5'-ATTGCGTGCGTTGGTGCGATC.......................TCCGTTAAGACTTCAGAAGGC-3'
3'-TAACGCACGCAACCTCGCTAG.......................AGGCAATTCTGAAGTCTTCCG-5'

Die ....... bezeichnen die dazwischenliegende Sequenz.
Wie du sagtest, benötigt die Polymerase ein freies 3'OH, kann also nur in 3'-5' Richtung polymerisieren.

Hier wäre ein Primerpaar, das an den gegebenen Sequenzen bindet:

Paar I:

1.) 5'-ATTGCGTGCGTTGGTGCGATC-3'
2.) 5'-GCCTTCTGAAGTCTTAACGGA-3'

Nun sage doch einmal, welcher Primer an welchem Strang bindet. Du kannst die Stränge dabei mit "oberer" und "unterer" strang bezeichnen.
Benenne dazu die Amplifikationsrichtung der Polymerase bezogen auf den Zielbereich (also "in den Zielbereich hinein" oder "aus dem Zielbereich heraus"). Wäre dieses Primerpaar für die Amplifikation des Zielbereiches geeignet?
Mache dir ferner Gedanken darüber, ob folgendes Primerpaar für die Amplifikation der mit ..... bezeichneten Zielsequenz ebenso tauglich/untauglich wäre:

Paar II

1.) 5'-GATCGCTCCAACGCACGCAAT-3'
2.) 5'-GGTATCCTTGCGTGCGTTGGAG-3'

Berücksichtige dabei die Amplifikationsrichtung der Polymerase. An welchem Strang bindet welcher Primer und in welche Richtung amplifizierte die Polymerase den Strang? Benutze hier wieder die Richtungsangaben bezogen auf die Zielsequenz (siehe oben).

Kurz: Welches der oben angegebenen Primerpaare würdest du zur Vervielfältigung des mit ...... markierten Bereiches einsetzen (Begründung?)?

Hast du noch Ideen, was weiterhin, also ausser den bereits genannten Faktoren wichtig sein könnte? Könntest du z.B. effektiv mit folgendem Primerpaar eine Zielsequenz vervielfältigen, selbst wenn die Primer diese Zielsequenz flankieren?

Paar III

1.) 5'-GATTGGCGTACGCTAGAGG-3'
2.) 5'-CCTCTAGCGTACGCCAATC-3'

Warum oder warum nicht?

_________________
RNA?- just another nucleic acid?


Zuletzt bearbeitet von jörg am 31. März 2012 15:18, insgesamt einmal bearbeitet
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3550
Wohnort: Hannover

BeitragVerfasst am: 31. März 2012 12:51    Titel: Antworten mit Zitat

Die Frage geht glaube ich etwas mehr ins Praktische.
Wenn man die Sequenz kennt, wie bei jörg geschrieben, dann kann man den ja ziemlich gezielt herstellen. Wenn er lang genug ist, ist die Wahrscheinlichkeit einfach sehr klein, dass er irgendwo anders (im Gen) bindet.
Schwieriger wird es, wenn man die Sequenz nicht kennt. Dann gibt es nur die Möglichkeit bei anderen Organismen zu schauen, ob man bei denen die Sequenz schon kennt, sodass man einen Primer verwendet, der bei denen passen würde, und damit wahrscheinlich auch halbwegs bei unserem Organismus passt. Dann wird der Primer ggf. etwas länger, da er dann auch hängen bleibt, wenn 10% der Basen nicht ganz passen.

Ansonsten muss man den Bereich, der einen interessiert, erst sequenzieren. Auf gut Glück einen Random-Primer zu nehmen, geht sicherlich auch. Ob es dann aber passt, ist reiner Zufall.

_________________
Die deutsche Rechtschreibung ist Freeware, du darfst sie kostenlos nutzen. Aber sie ist nicht Open Source, d. h., du darfst sie nicht verändern oder in veränderter Form veröffentlichen.
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2109
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 31. März 2012 13:07    Titel: Antworten mit Zitat

PaGe hat Folgendes geschrieben:
Ansonsten muss man den Bereich, der einen interessiert, erst sequenzieren.


Damit verschöbest du das Problem lediglich, denn auch die "Sequenzier-Polymerase" benötigt Primer.
Wenn die Frage also beinhaltet, wie man eine zu amplifizierende Sequenz, die man nicht kennt, überhaupt erst ausmacht, muss man auf zufällige Primer zurückgreifen. Man würde also z.B. ersteinmal "ins Blaue hinein" amplifizieren, die entstandenen Amplifikate dann in einen Vektor klonieren und über bekannte Primerbindungsstellen im Plasmidrückrat sequenzieren.

Kennt man flankierende Sequenzen der unbekannten Sequenz, könnte man die unbekannte Sequenz auch mit einer inversen PCR invertieren und dann sequenzieren. Aber eine Methode zur gezielten Amplifikation/Sequenzierung ohne die flankierenden Sequenzen zu kennen, ist mir nicht bekannt.

Ich denke aber, dass es eine technische Frage zum Primerdesign ist, zumal die Frage sich auf die Eigenschaften bezieht, die ein Primer haben muss.

Warten wir, wie prisma sich dazu äussert....

_________________
RNA?- just another nucleic acid?
Prisma
Gast





BeitragVerfasst am: 31. März 2012 13:17    Titel: Antworten mit Zitat

An Jörg

also ich glaube das bei Paar 1 1) gehört zum unterem Strang und das 2) gehört zum oberem Strang, jedoch verstehe ich nicht was du mit aus dem Zielbereich etc. meinst, jedenfalls glaube ich das beide in den Zielbereich hinein gehen.
Paar 2 1) passt zum oberem Strang jedoch weiß ich nicht was es mit der 2) auf sich hat ´, also wo das an den Strang passen würde. Außerdem glaube ich das Paar 2 1) aus dem Zielbereich hinausgeht. und bei paar 3) verstehe ich auch nicht wo das an der DNA ransollte ? Jedenfalls glaube ich das Paar 1 richtig ist.

bin so verzweifelt unglücklich
Prisma
Gast





BeitragVerfasst am: 31. März 2012 13:39    Titel: Antworten mit Zitat

Ich glaube das Paar 2 nicht funktionieren könnte, da keine 3`OH -Gruppe frei ist.
Prisma
Gast





BeitragVerfasst am: 31. März 2012 13:41    Titel: Antworten mit Zitat

Paar 3 könnte nicht funktionieren, da nur ein teil der DNA dann kopiert werden würde, da die Primer die Zielsequenz flankieren.
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3550
Wohnort: Hannover

BeitragVerfasst am: 31. März 2012 14:46    Titel: Antworten mit Zitat

@jörg:
Wenn man ein Protein untersucht, kann man ja ganz gut tippen, wie die Sequenz auf der DNA im Gen ist. Dann einfach einen Primer im Gen designen und man kann upstream sequenzieren.
Außerdem könnte man versuchen die mRNAs zu isolieren und hätte den Poly-A-Schwanz als Anfang. Allerdings dürfte es schwierig sein, genau seine mRNA zu isolieren.

_________________
Die deutsche Rechtschreibung ist Freeware, du darfst sie kostenlos nutzen. Aber sie ist nicht Open Source, d. h., du darfst sie nicht verändern oder in veränderter Form veröffentlichen.
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2109
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 31. März 2012 15:17    Titel: Antworten mit Zitat

@PaGe: Stimmt, wenn man das Protein kennt, das den "gesuchten Bereich" flankiert.... Aber dann kennt man die Sequenz ja quasi.
problematisch ist das trotzdem, da du nie weisst, was du wirklich amplifiziert hast. Da kommt schon manchmal das seltsamste Zeug heraus.

Ich habe nur auf Sequenzebene geschaut....

PaGe hat Folgendes geschrieben:
Allerdings dürfte es schwierig sein, genau seine mRNA zu isolieren.


ohne spezifische Primer durchaus....
Im nativen Gel siehst du eigentlich immer nur rRNA mit unspezifischen Färbemethoden (z.B. Ethidiumbromid).

@prisma:

Richtig, Primerpaar I passt und amplifiziert den gepunkteten Bereich.
Schauen wir uns dazu einmal an, wie die Primer binden:

an den oberen Strang bindet Primer 2.):

5'-ATTGCGTGCGTTGGTGCGATC.......................TCCGTTAAGACTTCAGAAGGC-3'
_______________________________<------3'-AGGCAATTCTGAAGTCTTCCG-5'

an den unteren Strang bindet Primer 1.):

5'-ATTGCGTGCGTTGGAGCGATC-3' ---->
3'-TAACGCACGCAACCTCGCTAG.......................AGGCAATTCTGAAGTCTTCCG-5'


Die Pfeile (------->) bezeichnen die Amplifikationsrichtung. Diese erfolgt also in den Zielbereich (gepunktete Linie) hinein.

Auch primerpaar II bindet an dem Strang, nur erfolgt die Amplifikation "nach aussen":

<------3'-TAACGCACGCAACCACGCTAG-5' (Primer 1.)
--------5'-ATTGCGTGCGTTGGTGCGATC.......................TCCGTTAAGACTTCAGAAGGC-3'


_____________________________(Primer 2.) 5'-TCCGTTAAGACTTCAGAAGGC-3'------>
3'-TAACGCACGCAACCTCGCTAG.......................AGGCAATTCTGAAGTCTTCCG-5'

Der Zielbereich lässt sich also nur mit Primerpaar I vervielfältigen, weil nur hier die freie 3'OH-Gruppen der Primer "aufeinander zeigen" und damit die Polymerase nur hier das Stück zwischen den angegebenen Sequenzen vervielfältigt.

Zu Primerpaar III:

Das soll gar nicht an einem der gegebenen Stränge binden, sondern die Frage bezieht sich ausschliesslich darauf, ob diese Primer zusammen verwendet werden sollten, wenn sie an der Zielsequenz binden. Wie verhalten sich diese Primer denn zueinander?
Achte dabei auf Komplementarität.
Was ist denn das Problem, wenn die beiden eingesetzten Primer antiparallel zueinander sind?

_________________
RNA?- just another nucleic acid?
Neue Frage »
Antworten »
    Foren-Übersicht -> Genetik

Verwandte Themen - die Neuesten
 Themen   Antworten   Autor   Aufrufe   Letzter Beitrag 
Keine neuen Beiträge PCR 4 VieleFragezeichen 2026 20. Sep 2018 14:36
Blipt1960 Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge Schwerpunktthemen Abitur 2018 Hamburg - wo findet man die P 2 [email protected] 1374 27. Aug 2017 23:39
DerDoofKopf Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge Primer designen 0 Gast 1682 05. Jul 2017 12:41
philsim Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge Produktgröße PCR 2 cajo 2064 01. März 2017 20:39
cajo Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge DNA- Primer 1 Alex_D 1653 29. Jan 2017 15:25
PaGe Letzten Beitrag anzeigen
 

Verwandte Themen - die Größten
 Themen   Antworten   Autor   Aufrufe   Letzter Beitrag 
Keine neuen Beiträge PCR 67 benno67 15421 09. Nov 2011 23:24
jörg Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge Wettbewerb: Wer findet das kurioseste Tier? 26 134340 15823 13. März 2012 10:54
Karon Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge Primer 9 anny12 4657 26. Okt 2011 00:24
PaGe Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge HILFE HILFE PRIMER 8 Aloscita 4778 14. Jul 2008 16:48
Bert Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge PCR-Methode? 7 Gast 10008 30. Okt 2012 17:07
Jenny_fragt Letzten Beitrag anzeigen
 

Verwandte Themen - die Beliebtesten
 Themen   Antworten   Autor   Aufrufe   Letzter Beitrag 
Keine neuen Beiträge Wo findet die meiose und mitose statt? 2 Gast 23611 19. März 2012 10:23
Yliese Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge chloroplasten is das alles so richtig?findet ihr ergänzungen 2 aumentato 16983 25. März 2005 13:32
Karon Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge Wettbewerb: Wer findet das kurioseste Tier? 26 134340 15823 13. März 2012 10:54
Karon Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge PCR 67 benno67 15421 09. Nov 2011 23:24
jörg Letzten Beitrag anzeigen
Keine neuen Beiträge Gelelektrophorese und PCR 5 Joline 10489 25. Feb 2008 18:52
revilo Letzten Beitrag anzeigen