Tanzbein Gast
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Verfasst am: 04. Apr 2015 09:09 Titel: Invertaseassay aus S. cerevisiae, wo ist mein Fehler |
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Meine Frage:
Hi Leute,
ich bin mitten in der Bachelorarbeit und soll ein Versuch zur Invertaseaktivität in meinem Organismus durchführen und selbst planen. Bevor ich damit durchstarte soll ich genau das erstmal mit der Bäckerhefe machen. Also habe ich mich durch die Literatur gestöbert und versucht ein ordentliches Protokoll aufzustellen und abzuarbeiten. Natürlich hat es nicht geklappt, deshalb bitte ich euch um Hilfe, wo ich denn den/die Fehler gemacht habe. Ich soll die Aktivität einer wt-Hefe und einer Suc2(Invertase codierendes Gen)-Deletionsmutante messern, einmal in Saccharose und einmal in Glukose gewachsen.
Meine Ideen:
Anzüchten der Hefe: ü.N. bei 25°C,200rpm, in 25ml(eine Kolonie reingesetzt) bei 2% Glukose/Saccharose in YEB.
Nächster Tag:
Abzentrifugieren der Proben bei 5' 3000rpm.
Pellet waschen mit MQ. Dann mit Extraktionspuffer resuspendieren(enthält:Glycerin, Tris/Hcl(pH 6,8),MgCl2,DTT,Pefabloc,EDTA,EGTA)
Öffnen der Zellen mit Glasperlen durch vortexen in 2ml Eppi, welches bis 1,7ml gefüllt ist davon bis 0,4ml mit Glasperlen. 10' vortexen, mit einem Spatel umrühren und nochmal 10'.
Zellsuspension von Glasperlen trennen, Glasperlen waschen mit Extraktionspuffer.
Zellsuspension abzentrifugieren: 4°C,17',13.000rpm. Überstand nehmen= Rohextrakt mit Invertasen.
Inkubation zur Aktivitätsmessung:
Ansatz: NaAc pH5,2; Saccharose,H2O,Rohextrakt.
60' bei 37°C inkubieren, abstoppen mit Tris/HCl pH 8
Inkubation bei 95°C für 5'
Zu jeder Probe wurde eine Kontrolle gemessen.
Gemessen wurde damm im Elisa Reader bei 340nm.
Der Ansatz war: Imidazol/HCl pH 6,9; NAD,ATP, G6-PDH. Kurzer Vorlauf, dann Zugabe vom Inkubationsansatz und Hexokinase.
Meine Ergebnisse waren überall gleich, ohne nennenswerte Aktivität.
Da meine Betreuer mir sagen, sie haben sowas noch nie gemacht und das ist jetzt mal meine Aufgabe, hoffe ich hier auf Hilfe.
Wäre unglaublich Dankbar =)
Denn ich bin irgendwie total Überfordert :/ |
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