Plasmide als Vektoren

highjumper · Anmeldungsdatum: 15.04.2007 Beiträge: 1

Hi

bin zum ersten mal hier und hoffe, ich stelle keine Frage wiederholt.

Also:
Ich schreibe am Mittwoch GK-Klausur und hab eine Frage zu Vektorplasmiden.

Wir haben gelernt, dass man zum Beispiel die menschliche DNA mit der "Anweisung" zur Insulinproduktion in das Plasmid eines Bakteriums einsetzetn kann. Um dann letztendlich auch wirklich nur Bakterien zu erhalten, die das gewünschte Gen mit sich tragen, führt man dann diese Antibiotikaaussonderungsmethode durch. Jetzt ist aber meine Frage, wie man überhaupt herausfindet, wo es jetzt genau sinnvoll ist, dass Restriktionsenzym schneiden zu lassen. Man benötigt ja die Basensequenz um zu wissen wo auf dem Plasmid die vorher vorliegenden Resisitenzgene liegen.
Und muss ich sonst noch etwas beachten wenn ich die DNA "einbauen will?

Vielen Dank schon mal für eure Hilfe.
Die Seite ist echt sehr gut gelungen und ich kann nur mein tiefes Lob und meine Anerkennung aussprechen..

highjumper

M!cha · Anmeldungsdatum: 22.12.2006 Beiträge: 52

Hi Du :I

Deine Info die du in den Vektor einbauen willst (=Insert) wird in einen ganz bestimmten Bereich auf dem Vektor eingebaut. Der Bereich heisst MCS (Multiple Cloning Side) und dort liegen die bekannten Sequenzen für verschiedene Restriktionsenzyme. Die AB-Resistenz liegt außerhalb der MCS und wurde vorher schon in den Vektor "reinkloniert", du käufst eigentlich direkt den entsprechenden Vektor mit AB-Resistengen und bekannter MCS beim Händler und legierst dein Insert dazu Zunge raus

Hier ein Bsp: Bluescript ist ein häufig verwendeter Vektor

http://www.geneservice.co.uk/products/cdna/datasheets/Dros_cDNA/pBluescriptSK-.gif

Beim Bluescript liegt die MCS zusätzlich noch innerhalb eines lacZ Gens, welches zusätzlich als Marker (neber AB-Resistenz) verwendet wird. Wird das Insert korrekt in die MCS eingebaut wird das lacZ-Gen unbrauchbar und differenziert dadurch die geglückte Klonierung.

Hoffe es is nicht zu ausführlich/kompliziert für dich Wink

Jay · Anmeldungsdatum: 11.03.2007 Beiträge: 21

also nimmt man für solche sachen auch pBR322? mit der tetracyllin und ampicillin resistenz? weil wird doch eine rausgeschnitten soweit ich weiß und dann kannste gucken, ob die erstmal den plasmid aufgenommen und integriert haben und ob der vektor auch die fremd- bzw. spender-dna aufgenommen hat? woah, morgen abi-klausur! :-(

croscha · Anmeldungsdatum: 28.01.2007 Beiträge: 72

hi,
für den Fall das du nicht morgen sondern Montag meintest noch mal viel glück! ( andernfalls viel glück nachträglich :-) )
So nun zum Vektor:
Deine Frage war wie man nun genau die richtige Sequenz findet um die Resistenzgene auf dem Plasmid zu zerlegen ( wenn ich dich richtig verstanden habe ).
Da hast du leider einen Denkfehler.
Die Antibiotikaresistenz wird als Indikator dafür genutzt das das Plasmid in das Bakterium integriert wurde, nicht dafür ob das insert eingebaut wurde, d.h. es geht nicht darum das eines der Antibiotikaresistenzgene zerlegt wird.
wenn das Plasmid vom Bakterium aufgenommen wurde so hat das Bakterium die Antibiotikaresistenz, das sagt aber noch nichts darüber aus ob das insert integriert wurde.
Heutzutage hat man künstliche Plasmide mit den sogenannten MCS ( siehe Abbildung M!cha ) diese MCS sind immer so aufgebaut das bekannte Restriktionsenzyme ihre Schnittstelle darin haben ( werden extra danach ausgesucht ) .man muss dann bloss mit dem geleichen Restriktionsenzym auch sein Insert ausschneiden dann passen die Schnittstellen zusammen.da man nicht unbedingt etliche dezimeter DNA umsonst intrgieren und dabei evtl andere Gene mitklonieren will guckt man sich vorher die Sequenz die man ausschneiden will an und sucht eine Schnittstelle eins Restriktionsezyms in der Nähe, wenn man eine gefunden hat sucht man dann einen Vektor bei dem in der MCS die Schnittstelle des gleichen Rest-enzyms liegt.
Um die gelungene Klonierung anzuzeigen wird das sogenannte bluescript oder auch blau/weiss Verfahren verwendet.
Dazu wird die MCS so in das Plasmid eingebaut das sie ohne das Leseraster zu zerstören innerhalb des Gens lacZ liegt ( kodiert für beta -Galaktosidase, meistens wird das aber ein bisschen abgewandelt gemacht in dem man als Trägerorganismus Bakterien verwendet die ein lacZ Gen tragen welches so mutiert ist, das das alpha Peptid ( sry keine ahnung wo es hier die griechischen Buchstaben gibt :-) ) der beta-Gal nicht gebildet werden kann. in die MCS wird dann ein ebenfalls mutiertes lacZ eingebaut dieses kodiert dann nur für das Alpha peptid, d.h. solange kein insert eingebaut wird kann das Bakterium beide Vorstufen der beta-Gal bilden und diese vereinigen sich zu funktionsfähiger beta-gal. wenn die beta-gal funktionsfähig ist wird das dem medium zugesetzte x-gal abgebaut und es bildet sich ein blauer farbstoff.
Wenn nun ein insert eingebaut wird verschiebt sich das Leseraster und das lacZ Gen ( bzw das mutierte lacZ) kann dadurch nicht mehr abgelesen werden .
Kolonien von E.coli die ein defektes lacZ haben färben sich dann weiss.
Also ist eine weisseKolonie das Zeichen dafür das die Klonierung gelungen ist und eine blaue zeigt an das kein insert eingebaut wurde.

Jay · Anmeldungsdatum: 11.03.2007 Beiträge: 21

gut, das hab ich denke ich mal verstanden smile

war schon richtig mit gestern, bio wurde in niedersachsen am samstag geschrieben, kam aber leider keine genetik/gentechnik dran, außer dna-dna-hybridisierung Wink