Frage zum Herstellen eines Insert.

p.m · Gast

Hallo,
voraus schon mal danke das ihr euch dafür zeit nehmt.

Ich habe folgendes Problem. Ich habe mit einer PCR ein Stück DNA vervielfältigt um es später in einem Vektor zu ligieren. Damit ich es ja ligieren kann habe ich meinen Vektor und mein Insert mit Restriktionsenzymen geschnitten (BamHI ; NdeI).Ligation hat wunderbar geklappt. Aber als ich nun meinen Vortrag machen wollte ( und ich habe größtenteils nach Anleitung gehandelt ^^) habe ich mir die Sequenz der Target DNA(also das Insert) und nirgens die Erkennungssequenz gefunden. Die Sequenzen (Insert;Restriktionsenzyme) stimmen alle , dreimal nachgeschaut.

Meine Frage also : Mir wurden die Primer bestellt . .. Haben die jetzt die Sequenz an die DNA "drangeheftet" ? Was hab ich unbewusst gemacht das ich das Insert mit Restriktionsenzymen schneiden musste?

Falls meine Aussagen ein wenig komisch sein sollten bzw. unlogisch bitte ich das zu entschuldigen ^^ --> Schüler smile

PaGe · Moderator Anmeldungsdatum: 19.03.2007 Beiträge: 3549 Wohnort: Hannover

Merkwürdig.
Woran hast du fest gemacht, dass die Ligation erfolgreich war?
Hast du Gelelektrophoresen gemacht?

p.m · Gast

Ja, hab ein die Ligation nochmal geschitten und auf einem Gel laufen lassen und die Banden haben von der Basenpaaranzahl des Fremdgens und des Vektors übereingestimmt. Aber was ich eben in meinem Versuch nicht verstehe warum ich keine Erkennungssequenz in meinem Insert für die Restriktionsenzyme habt....Hab zuerst die DNA aus der Hefe geholt und dann damit einen PCR ansatz gemacht. Und dort sollte ja die Target DNA herauskommen oder ? Aber in dieser Target DNA finde ich keine Erkennungssequenz für die Restriktionsenzyme. Und das ich die ganze DNA vervielfältigt habe kann auch nicht sein weil ich ja die Primer dafür bestimmt habe. Bloß bestellt halt nicht, das hat der Lehrer gemacht.

PaGe · Moderator Anmeldungsdatum: 19.03.2007 Beiträge: 3549 Wohnort: Hannover

Du hast also Insert (PCR-Produkt) und Vektor zusammengeworfen zum Ligieren. Dann hast du die Ligation gestoppt.
Hast du danach gleich ein Gel laufen lassen? Oder hast du vorher verdaut und dann das Gel laufen lassen? Hast du ein Bild?

p.m · Gast

Das Gelbild habe ich leider grad nicht parat , und ich habe es vorher verdaut. Das Problem ist aber ja nicht die ligation , die hat ja geklappt. Ich check bloß nicht wie es sein kann das mein Insert keine Erkennungssequenz für die enzyme hat --> und ich es trotzdem verdaut habe.(auf anweisung meines Lehrers) Wie funktioniert es denn bei einer "normalen Klonierung". Wie kommt man auf die Restriktionsenzyme bzw. woher weiß man welche Enzyme benutzt werden müssen?

P.S danke noch für die schnelle antworten

PaGe · Moderator Anmeldungsdatum: 19.03.2007 Beiträge: 3549 Wohnort: Hannover

Najam, wenn du die Ligation gleich wieder verdaust, kannst du zumindest nicht feststellen, ob die Ligation wirklich funktioniert hat. Eigentlich sollte man immer auch eine unverdaute Probe laufen lassen, um zu schauen, ob Insert + Vektor wirklich ein Plasmid formen.

Bleibt für mich die FRage, wie du überprüfst, ob die Ligation klappt.

Normalerweise sucht man erst einmal die DNA-Sequenz, die man klonieren will, und sucht kurz vor dem Gen mögliche Restiktionsstellen, die nicht im Gen vorhanden sind. Dann überprüft man, welche Restriktionststellen der Vektor in MulitpleCloningSide besitzt. Passt etwas, ist die Sache geritzt und man kann loslegen. Wenn es nicht passt muss man noch einen Linker einbauen. Das ist ein kurzes DNA-Stück, dass auf einer Seite eine Restiktionsstelle für den Vektor und auf der anderen Seite für das Insert besitzt.
Wenn man das Insert per PCR herstellt, wählt man halt die Primer so, dass sie kurz vor oder genau auf der Restriktionsstelle binden.

p.m · Gast

Hi , danke das war die fehlende Information smile

. Und danke für den Tipp ich werde nochmal ein Gel machen.
So jetzt muss ich nur noch die sequenzen heraussuchen.

also nochmals vielen dank