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Enzymaktivität bestimmen -Protokoll
 
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Missili
Gast





BeitragVerfasst am: 18. März 2017 11:22    Titel: Enzymaktivität bestimmen -Protokoll Antworten mit Zitat

hallo leute

ich bin gerade etwas am verzweilfen und ich weiß nicht weißer. ich hoffe hier kann mir jemand helfen.

Wir haben im Prakikum einen Versuch durchgeführt:

Zunächst haben wir ein Enzympräparat hergestellt. Dafür haben wir getrocknetes Blattmaterial zerkleinert mit so nem Mixer ähnlichen ding.dazu wurde ein Homogenisationspuffer dazugegeben und anschließend zentrifugiert. den überstand haben wir abgenommen.
Anschließend haben wir die enzymprobe für die nachfolgende bestimmungen der beta glucoosidase aktivität und für die protein bestimmung eingesetzt.

zur aktivitätsbestimmung haben wir anschließend folgendes gemacht:

probe + puffer in reagenzgläser das ganze temperiert bei 30 grad und mit der zugabe von dem p-NPG die reaiktion gestartet.
Jedenfalls muss ich das ganze natürlich auswerten und ich habe keinen Schimmer wie. Den einzigen wert den ich habe ist die Messung der extinktion im photometer. Ich muss nun doch die Enzymaktivität bestimmen und wogegen auftragen ?

Ich hoffe jemand kann mir helfen unglücklich(
missili
Gast





BeitragVerfasst am: 18. März 2017 11:36    Titel: Antworten mit Zitat

kann ich diese formel verwenden zur berechnung ?

(δ Aλ / min * 103) * (Protein insgesamt (in mg))-1
δ Aλ = Absorption der spektroskopierten Lösung mit passender Wellenlänge
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3549
Wohnort: Hannover

BeitragVerfasst am: 18. März 2017 11:58    Titel: Antworten mit Zitat

Es wäre schon sinnvoll, sich vor dem Versuch die Gedanken zu machen, wie man ihn auswertet.

Deine Formel hat kein Gleichheitszeichen. Daher kann man wenig dazu sagen. Wo kommt sie denn her? Dann bräuchtest du auf jeden Fall auch den Proteingehalt und theoretisch erst einmal eine Eichkurve, deren Ergebnis allerdings deine Formel sein könnte.
Was ich mich bei dem Versuch noch Frage, ob du wirklich nur einen Wert aufgenommen hast, oder eine Kurve der Absorption bei einer bestimmten Wellenlänge über einen Zeitraum. Alternativ wäre der Zeitpunkt der Einzelmessung interessant, denn eine Aktivität ist verknüpft mit einer zeitlichen Komponente.

_________________
Die deutsche Rechtschreibung ist Freeware, du darfst sie kostenlos nutzen. Aber sie ist nicht Open Source, d. h., du darfst sie nicht verändern oder in veränderter Form veröffentlichen.
missili
Gast





BeitragVerfasst am: 18. März 2017 12:15    Titel: Antworten mit Zitat

danke erstmal für die antwort !

die formel ist aus doccheck. Diese Formel bezieht sich speziell auf ein Enzym.

Also was ich gemacht hab ist folgendes. Ich hab meine Enzymprobe konzentriert, verdünnt 1:10 und 1:20 hergestellt. und dann in einem wasserbad inkubiert und in 30 s takt d-npg als star sozusagen hinzupipettiert. nach einer reaktionszeit habe ich meine probe zu einer stopplösung hinzugegeben. diese probe habe ich dann nmit Hilfe des photometers bemessen und nun muss ich die enzymaktivität ausrechnen, aber ich weiß nicht wogegen ich das gant auftragen soll.

Normalerweise kenne ich das bei enzymen so dass ich substraz gegen reaktionsgeschwindigkeit auftrage =/
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3549
Wohnort: Hannover

BeitragVerfasst am: 18. März 2017 16:49    Titel: Antworten mit Zitat

Du kannst nicht eine Absorption eines x-beliebigen Enzyms nehmen. Es fehlt eine Eichkurve, anhand der du die Konzentration bestimmen kannst. Des Weiteren wäre es sinnvoll, wenn man am Anfang auch die Absorption gemessen hätte, da nur so eine Abnahme quantifiziert werden kann.

Was bedeutet denn "nach einer Reaktionszeit"? Und du hast doch nicht in dieselbe Probe immer wieder etwas pipettiert, oder?

Gab es eine Anleitung zu dem Versuch, oder ist das eine Eigenentwicklung? Wenn es eine Anleitung gibt, schreib diese bitte einmal im Wortlaut hier auf. Aktuell habe ich den Eindruck, da fehlt einiges.

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missili



Anmeldungsdatum: 18.03.2017
Beiträge: 14

BeitragVerfasst am: 18. März 2017 21:38    Titel: Antworten mit Zitat

ja ich füg mal die vorschrift hinzu...kann das nicht so gut erklären.

danke für deine Hilfe!
missili



Anmeldungsdatum: 18.03.2017
Beiträge: 14

BeitragVerfasst am: 18. März 2017 21:53    Titel: Antworten mit Zitat

Als vorbereitende Arbeiten für die Aktivitätsbestimmungen sind zunächst auszuführen:
14 kleine Reagenzgläser werden beschriftet. Alle Komponenten der Inkubation (bis auf die Substratlösung) werden gemäß dem unten aufge-führten Schema in die kleinen Reagenzgläser pipettiert. Nun werden die für das Abstoppen notwendigen weiteren Reagenzgläser (ebenfalls 14) beschriftet und mit 3,5 mL Na2CO3-Lösung (Stopp-Lösung) gefüllt. Die Reagenzgläser mit den Inkubationslösungen werden zum Temperieren in das Wasserbad (30°C) gestellt.

Durch Zugabe des Substrates (500 mikroL p-NPG-Lösung , 10 mM) wird die enzymatische Reaktion gestartet. Bevor die zum Pipettieren entnommenen Reagenzgläser wieder in das Wasserbad gestellt werden, wird die Inkubationslösung mit Hilfe eines Reagenzglasschüttlers intensiv gemischt. Das Abstoppen erfolgt durch das Einbringen von 500 mikroL Inkubations-Lösung. Um zu gewährleisten, dass jede Probe exakt 10 min inkubiert wird, sind die jeweils in der Tabelle aufgeführten Zeitpunkte genau einzuhalten (Tabelle im Anhang)



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missili



Anmeldungsdatum: 18.03.2017
Beiträge: 14

BeitragVerfasst am: 18. März 2017 21:57    Titel: Antworten mit Zitat

Und das steht bei Auswertung:

Aus den Extinktionen sind jeweils Mittelwerte für die analogen Inkubationsansätze zu berechnen. Um Abschätzen zu können, welche der ermittelten Werte verlässlich sind, muss bekannt sein, welche Extinktion maximal (bei komplettem Umsatz des vorliegenden Substrates) erzielt werden könnte. Mit Hilfe des Lambert-Beer ́schen Gesetzes und unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten für p-Nitrophenol (im Alkalischen) E400= 18.650 L/mol*cm wird die maximal erzielbare Extinktion errechnet. Die experimentell bestimmten Extinktionen sollten maximal 20 % dieses Wertes betragen, andernfalls ergäben sich signifikante Falschbestimmungen durch Substratverknappung. Um keine Fehler aufgrund zu hoher Mess-Ungenauigkeiten durch sehr geringe Extinktionen zu begehen, sollte die Extinktion des Standard-Inkubations-ansatzes mindestens 0,1 betragen. Die Inkubationen, die diesen Kriterien genügen, können für die weitere Auswertung herangezogen werden. Durch Subtraktion der entsprechenden Blindwerte sind die Extinktionen zu ermitteln, die tatsächlich durch die enzymatische Bildung von p-Nitrophenol resultieren. Aus diesen Werten ist unter Berücksichtigung der Inkubationszeit die Enzymmenge (in Katal) zu berechnen (mit Hilfe des Lambert-Beer ́schen Gesetzes und unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten für p-Nitrophenol). Unter Einbeziehung aller Verdünnungs-Stufen und der verwendeten Volumina ist zunächst die gesamte Enzymmenge des erstellten Rohextrakts zu errechnen und dann die Enzymmenge, die pro g eingesetzten Blattma-terials vorliegt.

danke nochmal =)
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3549
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BeitragVerfasst am: 19. März 2017 11:11    Titel: Antworten mit Zitat

Die zeitliche Komponente ist damit geklärt. Es sind 10 Minuten.

Deine Eich-"kurve" sollst du mit dem Labert-beerschen Gesetz berechnen. Wenn du die maximale Extinktion berechnet hast, dann gehst du von einer linearen Abhängigkeit aus, sodass du theoretisch Konzentrationen angeben kannst.

Allerdings sollten wir uns vielleicht im Vorfeld noch einmal klar machen, weshalb ihr so viele Ansätze gemacht habt. Erst wenn du die Funktion verstanden hast, kannst du den Versuch auswerten. Dann leg mal los.

Wie man allerdings auf die Enzymmenge schließen soll, weiß ich aktuell auch noch nicht. Ist die Enzymaktivität bekannt und soll gar nicht ermittelt werden?

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missili



Anmeldungsdatum: 18.03.2017
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BeitragVerfasst am: 19. März 2017 12:25    Titel: Antworten mit Zitat

danke für deine antwort =)

genau. die enzymaktivität sollen wir ausrechnen. dafür haben wir auch folgendes im Skript was ich aber nicht ganz verstehe. muss ich stückeln weil zu wenig speicherplatz



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missili



Anmeldungsdatum: 18.03.2017
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BeitragVerfasst am: 19. März 2017 12:26    Titel: Antworten mit Zitat

bild nummer 2


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missili



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BeitragVerfasst am: 19. März 2017 12:27    Titel: Antworten mit Zitat

Bild nr 3


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missili



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BeitragVerfasst am: 19. März 2017 12:28    Titel: Antworten mit Zitat

bild nr 4


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PaGe
Moderator


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BeitragVerfasst am: 19. März 2017 14:35    Titel: Antworten mit Zitat

Ich bin nun etwas "irritiert". Es steht doch schon alles im Skript. Was verstehst du bei der Berechung der Aktivitäten nicht? In Zukunft gib bitte auch immer die komplette Aufgabe (wortgenau) wieder.

Bevor du nicht die Bedeutung der verschiedenen Ansätze herausgearbeitet hast oder konkrete Fragen hast, bin ich erst einmal raus.

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missili



Anmeldungsdatum: 18.03.2017
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BeitragVerfasst am: 19. März 2017 15:24    Titel: Antworten mit Zitat

also, zuert wusste ich nicht woher kommt die 8 bei der Rechnung, aber nun weiß ich, das ist der Verdünnungsfaktor.

Was mich aber trotzdem stört ist, wie kommt man von

c= 37,3 * 8 mmol/18,750 L * mL auf

c= 2 * 8 mmol/L*mL

Was ich nun gemacht habe ist folgendes: Ich habe die Mittelwerte der Extinktionen bestimmt also 1 u. 2 , 3 u. 4 usw und dann den Blindwert von allen abgezogen. Soweit so gut. Nun soll ich folgendes machen:

"Aus diesen Werten ist unter Berücksichtigung der Inkubationszeit die Enzymmenge (in Katal) zu berechnen (mit Hilfe des Lambert Beerschen Gesetzes und unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten für p-Nitrophenol). Unter Einbeziehung aller Verdünnungsstufen und der verwendeten Volumina ist zunächst die gesamte Enzymmenge des erstellten Rohextraktes zu errechnen und dann die Enzymmenge , die pro g eingesetzten Blattmaterial vorliegt"


Zuletzt bearbeitet von missili am 19. März 2017 22:27, insgesamt einmal bearbeitet
missili



Anmeldungsdatum: 18.03.2017
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BeitragVerfasst am: 19. März 2017 15:32    Titel: Antworten mit Zitat

wäre folgender Ansatz korrekt? Die reaktionsgeschwindigkeit ist ja die änderung der Konzentration mit der zeit:

v=dc/dt

nach lambert beer gilt:

dc= dE/(extinktionskoeffizient*d*dt)

und somit

v= dE/(extinktionskoeffizient*d*dt)

damit könnte ich dich nun v ausrechnen und nacheinander die E einsetzen?

Ich verstehe halt auch nicht was diese 66 nKat/mL im Skript sein sollen... grübelnd


Zuletzt bearbeitet von missili am 19. März 2017 22:29, insgesamt einmal bearbeitet
missili



Anmeldungsdatum: 18.03.2017
Beiträge: 14

BeitragVerfasst am: 19. März 2017 16:52    Titel: Antworten mit Zitat

Doppelpost
PaGe
Moderator


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Beiträge: 3549
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BeitragVerfasst am: 19. März 2017 22:46    Titel: Antworten mit Zitat

Sieht beim Überfliegen gut aus.
Bei der Enzymmenge hatte ich anfangs dasselbe Problem. Nun fällt mir wieder ein, dass man Enzymmengen nicht in Gramm o.ä. angibt, sondern (neuerdings) in katalytischen Einheiten.
https://de.wikipedia.org/wiki/Katal

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missili



Anmeldungsdatum: 18.03.2017
Beiträge: 14

BeitragVerfasst am: 20. März 2017 09:22    Titel: Antworten mit Zitat

und weißt du wie ich hierzu komme?


Aus diesen Werten ist unter Berücksichtigung der Inkubationszeit die Enzymmenge (in Katal) zu berechnen (mit Hilfe des Lambert Beerschen Gesetzes und unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten für p-Nitrophenol). Unter Einbeziehung aller Verdünnungsstufen und der verwendeten Volumina ist zunächst die gesamte Enzymmenge des erstellten Rohextraktes zu errechnen und dann die Enzymmenge , die pro g eingesetzten Blattmaterial vorliegt"

Gesamte Menge des rohexetaktes :/?
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3549
Wohnort: Hannover

BeitragVerfasst am: 20. März 2017 13:55    Titel: Antworten mit Zitat

Du hast doch nur x ml von deinem Gesamtextrakt genommen und mit 2 ml verdünnt. Nun musst du berechnen, wie konzentriert deine Ausgangslösung ist. Und wenn due es dann auf das Blattmaterial beziehen willst, musst du berücksichtigen, wie viel Blattmasse für das Extrakt verwendet wurde.
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missili



Anmeldungsdatum: 18.03.2017
Beiträge: 14

BeitragVerfasst am: 21. März 2017 10:18    Titel: Antworten mit Zitat

Also ich hab 423 mgg blattmaterial eingewogen und dass ganze in 7 ml himogenisationspuffer verdünnt.

Nach dem filtrat hatte ich ein Volumen von 6,5 ml im messzylinder. Das ist dann mein gesamtextrakt, oder? Und das haben wir dann gleichmäßig auf vier eppis verteilt, also ca 1,6 in jedem ... das heißt wir berechene ich jetzt wir konzentriert meine ausgangs Lösung war :/?
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
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Wohnort: Hannover

BeitragVerfasst am: 21. März 2017 15:45    Titel: Antworten mit Zitat

In 6,5 ml sind die Enzyme von 423 mg Blattmaterial gelöst. Ob du die in 2 oder 100 Portionen aufteilst, ist egal. Die Konzentration bleibt. Wenn du allerdings von einer Portion ein bestimmtes Volumen nimmst und dann wieder Lösungsmittel/Puffer hinzugibst, verdünnst du die Lösung und demnach ändert sich die Konzentration.
Schreib dir also noch einmal genau auf, wie die Lösungen verdünnt wurden, um dann von der mit dem Photometer ermittelten Konzentration wieder zur Ausgangslösung zurückrechnen kannst.

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missili



Anmeldungsdatum: 18.03.2017
Beiträge: 14

BeitragVerfasst am: 21. März 2017 17:05    Titel: Antworten mit Zitat

aso! danke! zurückrechnen kann ich dann mit dem lambert beerschen gesetz? also dann nach c umformen?
PaGe
Moderator


Anmeldungsdatum: 19.03.2007
Beiträge: 3549
Wohnort: Hannover

BeitragVerfasst am: 21. März 2017 23:05    Titel: Antworten mit Zitat

Mit dem Gesetz rechnest du die Konzentration deiner Messlösung. Die Ausgangskonzentration musst du anhand der Verdünnungen berechnen.
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Fricul64M



Anmeldungsdatum: 04.09.2018
Beiträge: 13
Wohnort: GERMANY

BeitragVerfasst am: 31. Okt 2018 10:27    Titel: Antworten mit Zitat

eine Aktivität ist mit einer zeitlichen Komponente verknüpft.
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