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Sequenzanalyse/ Ketten-Abbruch-Verfahren: Sanger
 
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Ellen
Gast





BeitragVerfasst am: 28. Sep 2004 16:36    Titel: Sequenzanalyse/ Ketten-Abbruch-Verfahren: Sanger Antworten mit Zitat

Wir haben heute in Bio Sanger und das Ketten-Abbruch-Verfahren angefangen zu behandeln. Unser Lehrer meinte, dass der Stopnukleotid immer aus einer Adeninbase besteht, warum? Und woran unterscheidet sich dieser Adeninbasennukleotid von den anderen Adeninbasennukleotiden? Ich weiß, dass der Abbruchnukleotid am 3. C-Atom des Zuckers das Sauerstoffatom fehlt, aber ist da sonst noch was anders am Abbruchnukleotid? Warum bricht der ab? Kann die Sequenz nach dem Abbruch sich auch wieder fortsetzen, also sozusagen nur Pause machen? Unser Lehrer war sich glaub ich selbst nicht ganz sicher mit manchen Sachen.
Ellen
Gast






BeitragVerfasst am: 28. Sep 2004 17:54    Titel: Antworten mit Zitat

Hallo Ellen,
Bei der DNA-Sequenzierung nach Sanger ("Kettenabbruchmethode") wird zunächst ein kurzes DNA-Fragment (Primer) an die zu sequenzierende DNA hybridisiert, d.h. eine kurze komplementäre DNA bindet an die lange zu untersuchende DNA. Dieser Primer wird von einer DNA-Polymerase in Anwesenheit von Desoxynukleotiden (dNTP= dATP, dCTP, dGTP und dTTP) verlängert. Zusätzlich befindet sich in dem "klassischen" Reaktionsansatz auch noch EINES von VIER Didesoxynukleotiden(ddNTP, ich nehme an, dieses Nukleotid meintest Du mit "Abbruchnukleotid"), jedoch nur in geringer Konzentration. Baut die Polymerase dieses Didesoxynukleotid ein, so kann der DNA-Strang nicht weiter verlängert werden, die Polymerase bricht ihr Werk ab und eine nicht vollständige Kopie des zu sequenzierenden Strages bleibt zurück. Beim Beispiel ddATP als Abbruchnukleotid bricht die Polymerase an einer Position in der Kopie ab, an der ein dATP eingebaut werden sollte (also einem "T" in der Matrize). Da diese Reaktion sehr oft durchlaufen wird, enstehen statistisch an allen Positionen mit einem "A" Abbruchprodukte. Diese Produkte werden dann elektrophoretisch ihrer Größe nach aufgetrennt und durch geeignete Verfahren sichtbar gemacht.
Auf diese Weise bekämest Du in unserem Beispiel aber nur die Positionen der "A" in der DNA heraus. Deshalb wird das Ganze parallel in drei weiteren Ansätzen (mit ddCTP, ddGTP und ddTTP statt ddATP) durchgeführt. In analoger Weise kannst Du damit die Position aller Basen ermitteln.
In neueren "Sequenzern" werden die vier ddNTPs aber häufig in einer Reaktion verwendet, die unterschiedlichen Abbruchprodukte sind dann z.B. durch geeignete Fluoreszenzmarker unterscheidbar (z.B. A=blau, C=grün etc.).
Was ist so besonders am Abbruchnukleotid? Eigentlich nichts, das 3'-OH am C3 des Zuckers, das dem Abbruchnukleotid fehlt, ist jedoch essentiell für die Verlängerung der DNA durch die Polymerase, weil dadurch die kovalente Bindung zum nächsten dNTP geknüpft wird. Fehlt es, kann die Kette nicht verlängert werden, das ist alles.
Es werden jedoch auch in einigen Verfahren veränderte Nukleotide verwendet, das ist aber für das Prinzip der Sanger-Sequenzierung nicht wichtig.
Kurz: In dem ursprünglichen Verfahren werden vier ddNTP in vier Reaktionen benötigt und das Abbruchnukleotid ist ein Didesoxynukleotid, ihm fehlt die OH-Gruppe am 3'-C-Atom. Ich hoffe, das war jetzt nicht zu verwirrend.
Ein zufälliger Besucher...
Ellen
Gast





BeitragVerfasst am: 03. Okt 2004 19:45    Titel: Vielen Dank! Antworten mit Zitat

Vielen Dank für deine Antwort!
Ellen
Gast





BeitragVerfasst am: 08. Jun 2005 18:10    Titel: auch Sequenzanalyse Antworten mit Zitat

Das ist ja witzig, ich heiße auch Ellen und habe gerade auch nach Erklärungen zum gleichen Thema gesucht.

Danke!
enzym
Gast





BeitragVerfasst am: 12. Jun 2005 17:12    Titel: Antworten mit Zitat

na das ist ein ding... und ich heiße Nils und suche auch nach Antworten zu diesem Thema... na welch ein Zufall... LOL Hammer
Gast2
Gast





BeitragVerfasst am: 13. Jan 2010 19:57    Titel: .. Antworten mit Zitat

wow geniale erklärung !
Gast0000001
Gast





BeitragVerfasst am: 30. Sep 2010 23:56    Titel: Antworten mit Zitat

ich hab da noch ne frage:
wie erkennt man anhand der bruchstücke die position der komplementären base innerhalb der dna?
chefin
Organisator


Anmeldungsdatum: 28.04.2004
Beiträge: 1549
Wohnort: Oberhausen

BeitragVerfasst am: 01. Okt 2010 15:45    Titel: Antworten mit Zitat

Durch eine Gelelektrophorese: Die Ansätze erden aufgetrennt und die Bande, die dann am weitesten gelaufen ist, ist die 1. Base, die am zweitweitesten gelaufen ist, die 2. usw. Ist ganz einfach abzulesen. Dann musst du den "erlesenen" Strang nur komplementär ergänzen und du hast die Nukleotidsequwnz deines Ursprungstranges. Schau mal hier: http://www.ursprung.at/ursprung/projekte_extern/ursprung99/graml/graml.html
_________________
Wissen ist Macht, Nichtwissen macht machtlos
Gast0000001
Gast





BeitragVerfasst am: 01. Okt 2010 18:45    Titel: Antworten mit Zitat

aber da nur die enden der bruchstücke makriert sind, wie soll man denn mit sicherheit sagen, dass zwischen 2 fast gleichgroßen bruchstücken nicht noch eine base liegt.
ist denn die gel elektrophorese so genau, dass man die länge bis auf das nucleotid genau bestimmen kann?
und ist die länge der moleküls proportional zur strecke, die es zurücklegt?
elementum
Ehrenmitglied


Anmeldungsdatum: 30.04.2006
Beiträge: 485
Wohnort: HD

BeitragVerfasst am: 01. Okt 2010 20:07    Titel: Antworten mit Zitat

hi gast,

um es kurz zu machen: ja, die elektrophorese ist so genau.

da du vier verschiedene ansätze hast (mit jeweils einem anderen ddNTP, also abbruchnukleotid), kannst du wirklich problemlos von unten nach oben ablesen.

hier mal nen kleines bildchen, da sieht mans sehr gut Augenzwinkern

_________________
"Allwissend bin ich nicht; doch viel ist mir bewusst" (Faust, V.1582)
Phillie
Gast





BeitragVerfasst am: 06. Nov 2011 17:17    Titel: Antworten mit Zitat

Oh. Danke zufälliger Besucher hast es besser erklärt, als mein Biobuch. Zwinkern
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