Sanger Sequencierung

akva · Anmeldungsdatum: 19.10.2011 Beiträge: 1

Meine Frage:
Sagner Secquencierung

Meine Ideen:
Beim Sanger-Sequenzierung nehmen wir den Strang 3'-5' und den Primer, der komplementär zu Anfang des Stranges ist. Strang, den durch den Primer angebaut wird (5'-3') wird sequenziert. Und dann in
Gelelektrophorese liest man genau den Strang 5'-3' von unten nach oben gelesen.
Und obwohl wir den Strang 5'-3' sequenziert haben, wollten wir die
Bestandteile des 3'-5' ermitteln und genau der (Strang 3'-5') ist der zu
sequenzierende Strang.

Sind meine Überlegungen richtig? Wenn ja, wieso können wir anstatt 3'-5' direkt den Strang 5'-3' nehmen, und dann wird den Strang 3'-5' durch den Primer verlangt und in Gelelektrophorese gelesen.

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Es ist natürlich möglich (und auch üblich), beide Stränge zu amplifizieren, indem man einfach jeweils die Ansätze mit einem sog. "forward" und einem "reverse"- Primer pipettiert. Schliesslich hat ja jeder Strang ein 3'- Ende, an dem der entsprechende Primer binden kann.
Du scheinst in deinen Überlegungen nicht berücksichtigt zu haben, dass die Polymerase eine kontinuierliche Amplifikation nur in 5'-3' Richtung vornehmen kann, sie kann also nur in 3'-5' Richtung lesen.
Also binden die Primer jeweils an den 3' Enden der Stränge und die Amplifikation erfolgt dann in 5'-3' Richtung.

Hast du denn eine Vorstellung davon, wie das mit der Sequenzierung konkret abläuft?

akv · Gast

Em, ich glaub ich habe es doch berücksichtigt.
Wir haben einen normalen Sequenz mit
3'------5'
5'------3'

Wir denaturieren sie und bekommen zwei Stränge
1. 3'----5' , wo sich primer an 3' ende bindet und verlangt den Strang 5'----3'
und
2. 5'-----3' , wo sich primer auch an 3' ende bindet-

Und ja, ich verstehe es schon.
Wir brauchen vier Desoxyribonucleosid- Triphosphate, die in alle 4 Flaschen zugeben werden, und in jede Flasche kommt nur ein Didesoxyribonucleosid- Triphosphat (ddATP, ddTTP, ddGTP und ddCTP). Wird ein Didesoxyribonucleosid- Triphosphat verbaut, so bricht die DNA-Polymerase aufgrund der fehlenden OH-Gruppe am C3'-Atom die Synthese ab.

Was ich nicht verstehe ist
wir haben Matritze

3'-GAGTAACGTGCA-5'
Primer 5'-c t
Und in die erste Flasche wird ddTTP zugegeben. Dann erhalten wir
5'-ctCAT
und
5'-ctCATT
und
5'ctCATTGCACGT

Wieso bei der Synthese von 5'ctCATTGCACGT wird sie nicht in 3 teile brechen. Ich meine wieso verlangt Polymerase den Strang obwohl es in der Lösung die ddTTP gibt.

Und habe ich es richtig mit der zu sequenzierende Strang verstanden? Wie sequnzieren eigentlich den Strang, der komplementär zu dem zu
sequenzierende Strang ist?

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

akv · Gast

Ok. Danke. Ich wollte noch mal fragen wie bildet man denn den komplementären Strang. Ich habe schon zwei Module Biochemie erfolgreich abgeschlossen, aber jetzt hat mich mein Professor verwirt. Er meinte :

original:
5'-GCATTCCA-3'

komplement des Originals:
5'-CGTAAGGT-3'

Wieso ist es nicht?
3'-CGTAAGGT-5'

Die Strränge sind doch im Doppelthelix nicht parallel zu einander, sindern antiparalel.
5'----3'
3'----5'

Danke

akv · Gast

Oder wieso ist es nicht auch ?
5'-TGGAATGC-3'

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg