Probleme mit der Zellkultur

Gast

Hallo!

Ich bin neu hier und über google auf euch gestoßen. Ich bin Labortechnikerin in einem Labor der Uni Wien und hauptsächlich für die Zellkultur zuständig.

Seit dieser Woche mehren sich aber Zwischenfälle mit meinen Kulturen, die ich euch kurz schildern möchte. Vielleicht hat ja wer den ultimativen Tipp für mich.

Normalerweise spalte ich die Flaschen am Freitag, damit sie bis Montag durchhalten und wieder konfluent sind. Hab ich natürlich auch letzte Woche so gemacht.

Dabei war dann in 1 Flasche (von 2) der Linie MCF-7 eine Infektion (hab ich sonst nie).

In 2 anderen Flaschen, die ich aus dem selben Tube wie die jeweils 2. Flasche der selben Linie gespalten habe, waren die Zellen seltsam verändert. Anstatt eines Zellrasens (wie in der jeweils anderen Flasche) waren nur einige Inselchen an Zellen in der Flasche. Wie man auf den Bildern hoffentlich sehn kann.

Für die MCF-7 verwende ich DMEM, für die beiden anderen RPMI.

Und heute, nachdem sich alles erholt hatte...stelle ich fest, dass meine LNCaP anscheinend mit einer anderen Zelllinie verunreinigt sind...ich habe sie aber schon seit Weihnachten in Kultur und es wäre mir nichts aufgefallen. Erst heute - dafür aber sehr eindeutig. Finde ich halt.

Hab ich einen Poltergeist im Labor, oder gibt es eine Erklärung dafür???

lg, Dani

Gast

So, jetzt bin ich auch eingeloggt... Wink

Noctu

hat sich was an den Kulturbedingungen geändert ? So, andere Charge FCS, schlecht oder zulange hitzeinaktiviert. Andere Kulturflaschen ?
Coatest Du vorher mit PLL/PDL , oder einer ECM ? Glutamin abgelaufen ?

Sieht aber fast so aus als hättest Du Mycoplasmen eingefangen.
Mal eine Färbung mit Bisbenzimid machen.
Die Mischkultur würde ich abschicken, die bekommst Du nicht mehr getrennt !

Gruß
N.

Khoda · Gast

Prinzipiell kann es sich um Mycoplasmainfektionen handeln, die man leicht mit Hoechst 33342 etc. nachweisen kann, oder um Wachstumskrisen zu handeln, die wirklich an ALLEM liegen können; es kann vorkommen, das nach der Subkultivierung in einer Flasche alles gut läuft, während in der andren aus unerfindlichen Gründen eine Wachstumskrise einsetzt. Alles schon erlebt.

Sollten dennoch die Kulturen nicht infiziert sein, könntest du versuchen, die in die Krise geratenen Zellen zunächst in kleineren Kulturflaschen bis hin zu Mikrotiterplatten aufzuziehen und dann nachwachsen zu lassen.

Die kontaminierten LNCaP kannst du getrost in die Tonne kloppen - ohne Einzel-Zell-Klonierung in 96-well-Mikrotiterplatten würdest du die nie mehr trennen können.

Ansonsten: Neukultivation mittels Glycerolstocks oder, sofern auch die kontaminiert bzw. in der Krise geraten sollten, ist ein Neukauf der Zelllinien zu empfehlen.

Im Übrigen könnten auch andere an den Kulturen rumgefummelt haben. Sabotagespäßchen sind nicht gerade selten und immer in Erwägung zu ziehen, sofern man keine rationalen Erklärungen findet .........

Gast

Hallo!

Danke für die schnellen Antworten.

Zu den Fragen: Nein, an den Bedingungen hat sich nix geändert...alles die selben Flaschen.

Ich hab alles schon entsorgt - gleich nachdem ich die Fotos gemacht habe, da es eh nur Krebszellen sind, die wir noch tonnenweise im N2 gefroren haben. Aber interessant ists schon, was es so sein kann.

Es ist halt komisch, dass gerade bei 2 unterschiedlichen Linien (HT-29 und HCT-15) das selbe seltsame Spielchen passiert ist. Und das, wo ich beide Flaschen aus dem selben Tube aufgeteilt hab...*strange*

Die Zellmischung ist auch seltsam...kann das sein, dass das erst nach einiger Zeit der Kultivierung zu Tage tritt? Letzte Woche hat die selbe Linie noch ganz normal ausgeschaut...

Ich mach jetzt seit 3 Jahren ZK...aber so ein Häufung an Seltsamkeiten ist mir ja doch noch nie untergekommen.

Ich hatte mal PASMCs (Glattmuskelzellen) in Kultur...die sind anfangs wie nix gewachsen, dann immer schlechter...am Schluss hatten wir sie schon in 25cm Dishes kultiviert...und 1x im Monat gespalten, wenns hoch kam...Aber die haben wir in der Zwischenzeit auf Eis gelegt.

lg, Dani

Noctu

tja, auch die Zellen altern mal.
Selbst Deine Carcinom-Zellinien geben mal den Geist auf. Bei so vielen Passagen kommt es unweigerlich zu fehlerhaften Kernteilungen.
Wenn Du nochmal sowas beobachtest, dann sinds bestimmt Mycoplasmen, dann alles entsorgen, komplett neue Medien usw ...

Noch ein Tip: das 37°C Wasserbad beim auftauen aus dem N2 ist gerne eine Kontaminationsquelle. Deshalb das Vial vor dem öffnen mit EthOH reinigen und das wasser z.B. mit Benzalkoniumchlorid stabilisieren.

SemiBoes · Anmeldungsdatum: 16.02.2006 Beiträge: 1 Wohnort: Wien

Hallo!

Ok, danke für die Tipps - Wasserbadwasser ist stabilisiert...aber nochmal mit Et-OH abwischen ist sicher a net schlecht...obwohl ich eh immer noch alles abflamm, bzw. mit Et-OH abwisch im Flow dann.

Aber so viele Zwischenfälle wie diese Woche hatte ich insgesamt die letzten 3 Jahre nicht...Wird sich hoffentlich wieder beruhigen...

lg, Dani

InCelligence · Anmeldungsdatum: 08.09.2014 Beiträge: 5 Wohnort: Bremen

Hallo,

ich habe gerade deinen Eintrag gesehen. DAs klingt ja echt übel smile

Also zu der sogenannten Kreuzkontamination kann ich dir sagen, dass sowas häufig passiert, wenn man zwei Linien gleichzeitig unter der Bank hat. Dann dauert es aber meist 2-8 Wochen, bis man es tatsächlich merkt, weil die kontaminierende Linie langsam die andere überwächst.

Kontaminationen hat man schon mal und je nachdem was man wie stark kontaminiert, kann schon eine Flasche suaber und die andere kontaminiert sein. Zum Erhöhung der Sicherheit ist das reinigen von Kryos mit Ethanol super. Abflammen sollte man gar nicht mehr. Die Bänke heute sind anders und der Bunsenbrenner macht eher Probleme, als dass er hilft.

Falls du noch ein bischen mehr über Kontaminationen lesen willst:
www.incelligence.de

Viele Grüße,
Nicole