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Klonierung
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anne100
Gast





BeitragVerfasst am: 09. Nov 2011 11:28    Titel: Klonierung Antworten mit Zitat

Meine Frage:
hi!
kann mir bitte jemand erklären was eine gerichtete und ungerichtete klonierung ist?

Meine Ideen:
hab schon in büchern und im internet gesucht aber ich hab leider nichts gefunden.
anne100
Gast





BeitragVerfasst am: 09. Nov 2011 17:25    Titel: Antworten mit Zitat

hat wirklich keiner einer idee? das ist wirklich wichtig!!!
was versteh man eigentlich auch unter sticky ends mit 5'überhang und sticky end mit 3'überhang?
Jaamar



Anmeldungsdatum: 14.06.2010
Beiträge: 119

BeitragVerfasst am: 09. Nov 2011 17:36    Titel: Antworten mit Zitat

hey!
weißt du wie und woraus die dna aufgebaut ist und warum sie eine "richtung" hat?
anne100
Gast





BeitragVerfasst am: 09. Nov 2011 21:22    Titel: Antworten mit Zitat

HILFE!!!
Jaamar



Anmeldungsdatum: 14.06.2010
Beiträge: 119

BeitragVerfasst am: 09. Nov 2011 21:45    Titel: Antworten mit Zitat

na gut. dna besteht aus sogenannten nukleotiden. das sind ribosezucker, die mit einer base und einem phosphatrest verbunden sind:

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f5/Nucleotide_nucleoside_general.svg/800px-Nucleotide_nucleoside_general.svg.png

die kohlenstoffatome sind numeriert (1', 2', 3', 4', 5'). jetzt sind diese nukleotide untereinander verbunden. und zwar immer das 5'-c mit dem 3'-c.
das sieht dann etwa so aus:

http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Chemische_Struktur_der_DNA.svg&filetimestamp=20090617060254

dies ergibt die richtung. nämlich ein strang geht 5'-3' und der andere 3'-5' (da sie antiparalell sind).
auf dem vorigen bild sieht man das ganz gut. daraus ergibt sich, dass am 5'-ende sich immer ein phosphatrest und am 3'-ende ein OH-rest befindet ==> richtung.

so jetzt ein bisschen weiter. ein sticky-end ergibt sich wenn wir die dna mit bestimmten restriktionenzymen schneiden.


3'-AGTTAGGTACC-5' 3'-AAA-5'
5'-TCAAT-3' 5'-CCATGGTTT- 3'

das ist eine schnittstelle mit sticky-ends (mit 5' überhang). die dna wurde nicht glatt (blunt) geschnitten, sondern mit sticky ends.

so nun zu deiner ursprünglichen frage. ein ein blunt geschnittenes dna-stück kann man inserts auf auf 8(??? da bin ich mir nicht sicher) verschiedene weisen einbauen. je nachdem wie man das dna-stück dreht und wendet. da es bei einer klonierungs zufällig passiert bekommt man die verschiedensten variationen. ==> ungerichtete klonierung

aus diesem grund fügt man inserts in sticky geschnittene dna ein (das insert muss man dazu ebenfalls mit den selben enzymen schneiden). dann überlappen die jeweiligen enden und es gibt prinzipiell nur eine richtung, in die das insert eingebaut werden kann. ==>gerichtete klonierung.

so ich hoffe das hat geholfen.
anne100
Gast





BeitragVerfasst am: 10. Nov 2011 20:54    Titel: Antworten mit Zitat

also irgendwie versteh ich das nicht mit der gerichteten und ungerichtetn klonierung. kannst du das vllt nochmal anders erklären?
anne100
Gast





BeitragVerfasst am: 11. Nov 2011 11:00    Titel: Antworten mit Zitat

also kann man sagen dass die ungerichtete klonierung vorliegt wenn blunt ends entstehen. und beid er gerichteten klonierung entstehen sticky ends. soweit richtig? aber das mit der richtung ist mir nicht ganz klar. gibt es dazu vllt ein passendens bild zur veranschaulichung?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 11. Nov 2011 14:30    Titel: Antworten mit Zitat

anne100 hat Folgendes geschrieben:
also kann man sagen dass die ungerichtete klonierung vorliegt wenn blunt ends entstehen. und beid er gerichteten klonierung entstehen sticky ends. soweit richtig?


Bei der Klonierung entstehen gar keine Enden; die Enden werden zur Klonierung erzeugt.
Ausserdem ist das so, wie jaamar das gesagt hat auch nicht ganz richtig. Auch wenn mit nur einem Restriktionsenzym geschnitten wird, das klebrige Enden erzeugt, ist die Klonierung ungerichtet. Für eine gerichtete Klonierung muss also mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten werden.


anne100 hat Folgendes geschrieben:
aber das mit der richtung ist mir nicht ganz klar. gibt es dazu vllt ein passendens bild zur veranschaulichung?


Dann fangen wir am besten noch einmal vorne an.
Wie jaamar schon fragte: Wie ist die Ausrichtung der DNA?
Was sind Restriktionsenzyme und welche verschiedenen Typen gibt es?

Ein Bild dazu habe ich nicht gefunden, doch wenn wir das hier erarbeiten, zeichne immer schön deine Vorstellungen auf, dann machst du dir selber ein Bild davon (ist eh immer am besten).
Beginnen wir dazu mit der gerichteten Klonierung:
Wieviele Möglichkeiten hast du, eine Insertion einzufügen, wenn du sowohl den Vektor als auch die Insertion mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen, die beide klebrige Enden mit 5'-Überhängen erzeugen, geschnitten hast? Begründe.

Es wäre auch hilfreich, wenn du mitteiltest, was du machst und wofür du das brauchst.

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anne100
Gast





BeitragVerfasst am: 11. Nov 2011 18:00    Titel: Antworten mit Zitat

Hi. also ich brauch das für die uni. ich sttudier bio auf lehramt und wir haben da so eine aufgabe bei ich das anwenden muss. deswegen wärs ganz gut wenn ich das verstehe.

die dna ist ja wie schon gesagt antiparallel
also 5'-....-3'
3'-....-5'

und restriktionsenzyme erkennen ja bestimmte sequenzen auf einem dna-strang und schneiden diesen. dabei gibt es endonukleasen (schneiden im Innern eines strangs) und exonukleasen (bauen strang vom ende her ab). und bei den endonukleasen unterscheidet man noch typ 1 und typ 2.

dann zur gerichteten klinierung:
also es ist wirklich immer so das hierbei mit zwei verschiedenen restriktionsenzymen geschnitten wird ja? dann ist es ja so dass das eine ende des vektors bzw. inserts mit dem einen RE und das andere ende des inserts bzw. vektors mit dem anderen RE geschnitten wird richtig?
die beiden verwendeten RE erkennen ja dann unterschiedliche sequenzen und schneiden diese. das heißt ja eigentlich dass die insertion die dabei entsteht, ja unterschiedliche überhänge (also nicht an beiden seiten die gleichen) hat. und damit ist ja eigentlich die richtung wie das insert eingebaut werden muss vorgegeben. ddenn wenn man die enden vertauschen würde würden sie ja nicht mehr zusammenpassen.
ok also ich hab noch schwierigkeiten mir das vorzustellen. also eigentlich haben ja dann insert und vektor die gleichen enden (das eine von RE1 und das andere von RE2)

z.B. 5'-...A 3' 5'-GATCC...3'
3'-...TCTAG 5' 3'-G...5'

Ende 1 Ende 2

diese enden haben sowohl vektor als auch insert nach dem
schneiden mit unterschiedlichen RE oder?
und es muss dann immer ende 1 von vektor mit ende 2 von insert gepaart werden oder eben umgekehrt. damit kann man nicht ende 1 mit ende 1 oder ende 2 mit ende 2 paaren. ist das mit der richtung gemeint?
anne100
Gast





BeitragVerfasst am: 11. Nov 2011 18:02    Titel: Antworten mit Zitat

oh das ist jetzt etwas verrutscht. hoffentlich bleibt es jetzt so.

5'-...A 3' 5'-GATCC...3'
3'-...TCTAG 5' 3'-G...5'
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 11. Nov 2011 23:29    Titel: Antworten mit Zitat

Im Prinzip hast du es, so glaube ich, richtig gesagt, obwohl ich deine Bezeichnungen etwas kryptisch finde.

Ich hätte es einfacher gefunden, wenn du die Enden entsprechend der Enzyme bezeichnest, also wenn du das Ende, das mit "RE1" (um in deiner Nomenklatur zu bleiben) erzeugt wurde auch "Ende 1" genannt hättest, und zwar sowohl im Vektor als auch im Insert und das mit "RE2" erzeugte Ende "Ende2".
Noch einmal zu der Sequenz: Sie ist zwar palindrom, würde aber in der Regel so von einem Restriktionsenzym nicht erzeugt werden.
Warum nicht?

anne100 hat Folgendes geschrieben:

und restriktionsenzyme erkennen ja bestimmte sequenzen auf einem dna-strang und schneiden diesen. dabei gibt es endonukleasen (schneiden im Innern eines strangs) und exonukleasen (bauen strang vom ende her ab).


Können Restriktionsenzyme wirklich auch Exonukleasen sein?


Und dann weiter: Wieviele Möglichkeiten hast du, eine Insertion einzufügen, wenn beide Enden sowohl des Vektors als auch des Inserts mit demselben Restriktionsenzym geschnitten werden? Begründe.

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anne100
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BeitragVerfasst am: 13. Nov 2011 08:44    Titel: Antworten mit Zitat

also ist es richtig wenn ich sage dass bei der gerichteten klonierung sowohl vektor als auch insert mit zwei unterschiedlichen RE geschnitten werden. dadurch entstehen unterschiedliche überhänge die so zusagen die richtung in die das insert in den vektor eingebaut werden muss, vorgeben. denn wenn man das insert drehen würde, würden die enden nicht mehr zueinander passen. d.h. bei der gerichteten konierung ist nur eine orientierung des inserts zum einbau in den vektor möglich. so richtig?
am beispiel kann ich mir dass doch so vorstellen, dass wenn ich das insert jetzt drehen würde sprich das GATC unten und CTAG oben ist, dann würde es ja nicht mehr in den vektor passen, weil die seuquenzen ja dann sozusagen die gleichen wären die gepaart werden und das geht ja nicht. kann ich mir das so vorstellen?

ich dachte dass ende 1 wäre von RE1 und das ende 2 von RE 2? wie muss das denn dann sein?


hier ist das insert:

5' GATC 3'
3' CTAG 5'

5'-...A 3' 5'-GATCC...3'
3'-...TCTAG 5' 3'-G...5'

Ende 1 Ende 2
(von RE1) (von RE 2)

ist das so falsch?
und wieso würde die sequenz nicht erzeugt werden?

ich hab gelernt dass zu den RE auch exonukleasen gehören...

und wenn man bei enden mit dem gleichen RE schneidet, dann entstehen ja die gleichen überhänge und ich hab mehrere (ich glaub zwei) möglichkeiten das insert einzubauen, je nachdem wie man es dreht. also ist die richtung nicht vorgegeben. damit wäre das die ungerichtete klonierung. richtig so?

beispiel wäre:

5'...G 3' 5' AATTC...3'
3'...CTTAA 5' 3' G...5'

und das insert hätte dann die sequenz:

AATT
TTAA

und hier sieht man ja dass egal wie man es dreht die überhänge immer zu den enden passen.
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
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BeitragVerfasst am: 13. Nov 2011 12:58    Titel: Antworten mit Zitat

anne100 hat Folgendes geschrieben:
also ist es richtig wenn ich sage dass bei der gerichteten klonierung sowohl vektor als auch insert mit zwei unterschiedlichen RE geschnitten werden. dadurch entstehen unterschiedliche überhänge die so zusagen die richtung in die das insert in den vektor eingebaut werden muss, vorgeben. denn wenn man das insert drehen würde, würden die enden nicht mehr zueinander passen. d.h. bei der gerichteten konierung ist nur eine orientierung des inserts zum einbau in den vektor möglich. so richtig?


Das ist so richtig, deine bildhafte Beschreibung jedoch ist unzulänglich und ich glaube, es mangelt dir etwas an dem Verständnis, was Restriktionsenzyme sind, wie sie arbeiten und was gleichartige Enden sind, denn:




anne100 hat Folgendes geschrieben:

5'-...A 3' 5'-GATCC...3'
3'-...TCTAG 5' 3'-G...5'

Ende 1 Ende 2
(von RE1) (von RE 2)


Diese beiden Enden sind gleich. Betrachten wir sie dazu einmal in der gleichen Ausrichtung, also beide Überhänge von 3'-5', so steht dort:

Ende1: 3'-CTAG-5'
Ende2: 3'-CTAG-5'

Du siehst, es sind die gleichen Überhänge, werden also von dem gleichen Restriktionsenzym erzeugt.




anne100 hat Folgendes geschrieben:
und wieso würde die sequenz nicht erzeugt werden?


Weil die meisten Restriktionsenzyme in dem Palindrom schneiden, das sie erkennen oder einige Nukleotide entfernt davon, aber ich kenne keines, das das Palindrom genau an seinem Rand schneidet. Zur Klonierung werden allerdins vorwiegend und fast ausschliesslich solche benutzt, die in dem Palindrom schneiden, weil nur hier die Sequenz des Überhanges zuverlässig bestimmbar ist.
Nehmen wir einmal an, das RE schneidet sagen wir mal 12 Nukleotide stromabwärts des Palindroms, das es erkennt, so können die entstehenden Sequenzen im Vektor ganz andere sein als im Insert. Also betrachten wir nur Restriktionsenzyme, die in der palindromen Sequenz schneiden.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
ich hab gelernt dass zu den RE auch exonukleasen gehören...


Da hast du etwas falsches gelernt. Um einen Strang "vom Rande" her abzubauen bedarf es keiner Sequenzspezifischen Erkennung, sondern lediglich der Erkennung des Endes, also 5' oder 3'. Es gibt Exonukleasen, die einen Strang vom 5'-Ende abbauen und solche, die es vom 3'-Ende abbauen, aber keine, die eine bestimmte Sequenz brauchen, um zu schneiden. Die spezifische Sequenzerkennung ist eine Eigenschaft explizit der Endonukleasen. Die Restriktionsendonukleasen zeichnen sich zudem dadurch aus, dass sie palindrome Sequenzen erkennen.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
und wenn man bei enden mit dem gleichen RE schneidet, dann entstehen ja die gleichen überhänge und ich hab mehrere (ich glaub zwei) möglichkeiten das insert einzubauen, je nachdem wie man es dreht. also ist die richtung nicht vorgegeben. damit wäre das die ungerichtete klonierung. richtig so?


Stimmt, nur dass dein oben genanntes Beispiel aufgrund der Sequenzgleichheit auch eine ungerichtete Klonierung wäre.
Der Unterschied ist also klar, es fehlt nur an der Einschätzung, was eigentlich Sequenzgleichheit bedeutet.
Ich hoffe, ich konnte das oben etwas klar machen.

Kannst du versuchen, auf dieser Grundlage noch einmal ein richtiges Beispiel für eine gerichtete Klonierung zu geben?

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anne100
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BeitragVerfasst am: 13. Nov 2011 13:59    Titel: Antworten mit Zitat

also ein bespiel für gerichtete klonierung könnte dann sein:

man hat jetzt die sequenz:

5'- ...GAATTC......AGATCT...-3'
3'- ...CTTAAG......TCTAGA...-5'

dann erhält man:

5'-...G 3' 5' AATTC...-3'
3'-...CTTAA 5' 3'G...-5'

und

5'...A 3' 5' GATCT...3'
3'...TCTAG 5' 5'A...3'

und wenn ich z.B ein vektor hat der mit REs geschnitten wird dann ist es doch richtig dass durch den Schnitt der RE ein teil der sequenz herausgeschnitten wird oder wird der vektor damit nur geöffnet? nein oder weil nach dem beispiel sieht es ja auch so aus dass ein teil herausgeschnitten wird. ist bestimmt ne doffe frage aber ich will es halt richtig verstehen...

und vllt kannst du das mit dem 3'-und 5'-überhang nochmal erklären weil da komm ich immer durcheinander. wie erkenn ich denn was was ist?
jörg



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BeitragVerfasst am: 13. Nov 2011 14:38    Titel: Antworten mit Zitat

anne100 hat Folgendes geschrieben:


man hat jetzt die sequenz:

5'- ...GAATTC......AGATCT...-3'
3'- ...CTTAAG......TCTAGA...-5'


Das soll der Vektor sein?
Das sieht dann schon mal gut aus:
Zwei unterschiedliche Palindrome Sequenzen! Thumbs up!


anne100 hat Folgendes geschrieben:


dann erhält man:

5'-...G 3' 5' AATTC...-3'
3'-...CTTAA 5' 3'G...-5'

und

5'...A 3' 5' GATCT...3'
3'...TCTAG 5' 5'A...3'


Hier ist dann jeweils eines der Vektor und das andere das Insert?
Dann sieht auch das gut aus.


anne100 hat Folgendes geschrieben:
und wenn ich z.B ein vektor hat der mit REs geschnitten wird dann ist es doch richtig dass durch den Schnitt der RE ein teil der sequenz herausgeschnitten wird oder wird der vektor damit nur geöffnet?


Mit einem Restriktionsenzym, das nur an einer Stelle schneidet, würde der Vektor nur geöffnet werden, mit zei verschiedenen allerdings deletierst du auch einen Teil der Sequenz. Schau die dazu einmal die "multiple-cloning-sites" der kommerziellen Plasmidvektoren an.


anne100 hat Folgendes geschrieben:
und vllt kannst du das mit dem 3'-und 5'-überhang nochmal erklären weil da komm ich immer durcheinander. wie erkenn ich denn was was ist?


Die meisten Restriktionsenzyme generieren 5'-Überhänge. Es gibt aber auch welche, die 3'-Überhänge generieren. Das muss man über das jeweilige RE wissen, erkennen kann man das sonst schwer.
Ein Konsens ist, dass Sequenzen, wenn nur ein Einzelstrang beschrieben ist, immer in 5'-3'-Richtung angegeben sind, also entsprechend der kodierenden Sequenz. Wenn man dann weiss, an welchem Nukleotid der Schnitt vollzogen wird, kann man sich das bei Vergleich der Sequenzen vor und nach dem Schneiden herleiten.
Aber wenn man die Schnittweise des Enzyms kennt, weiss man ja meistens auch, was für einen Überhang sie generieren.
Wie gesagt: Am besten ist es, du schaust dir das für jedes Enzym, das du benutzen möchtest, an (die Hersteller von Restriktionsenzymen geben da immer Listen heraus und ich muss da bei Klonierungen auch oft noch drauf gucken, um genau zu wissen, wo die Enzyme schneiden und was für einen Überhang sie generieren). Eine Regel oder ähnliches dafür gibt es nicht.

Nun bleibt noch eine Variante der ungerichteten Klonierung übrig:
Wieviele Möglichkeiten hast du, eine Insertion einzufügen, wenn glatte Enden ohne Überhänge erzeugt wurden?
Auch hier bitte mit Begründung.

Wenn du allerdings zu bisher erarbeiteten Zusammehängen noch Fragen hast, sollten wir die zuerst klären. Für mich sieht es aber so aus, als hättest du es.

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anne100
Gast





BeitragVerfasst am: 13. Nov 2011 17:02    Titel: Antworten mit Zitat

bei der ungerichteten klonierung mit glatten enden kann man das insert ja so einfügen wie man will da sind ja keine überhänge die man beachten muss. ich glaub da hat man vier möglichkeiten das insert einzufügen oder? je nachdem wieder wie man dreht...
aber was ich hier nicht verstehe ist wenn man das insert jetzt in einen vektor einfügt, wie werden vektor und insert dann verknüpft? weil bei sticky ends sind ja dann eben diese überhänge die komplementär binden und bei den blunt ends?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
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BeitragVerfasst am: 13. Nov 2011 17:44    Titel: Antworten mit Zitat

anne100 hat Folgendes geschrieben:
bei der ungerichteten klonierung mit glatten enden kann man das insert ja so einfügen wie man will da sind ja keine überhänge die man beachten muss. ich glaub da hat man vier möglichkeiten das insert einzufügen oder? je nachdem wieder wie man dreht...


Beachte bitte, dass ein 3'-Ende nicht mit einem 3'-Ende verknüpft werden kann.
Hast du dann wirklich 4 Möglichkeiten?
Jaamar schrieb in einem der ersten beiträge, es gäbe sogar 8 Möglichkeiten.
Ich sehe eigentlich nur 2 Möglichkeiten...


anne100 hat Folgendes geschrieben:
aber was ich hier nicht verstehe ist wenn man das insert jetzt in einen vektor einfügt, wie werden vektor und insert dann verknüpft? weil bei sticky ends sind ja dann eben diese überhänge die komplementär binden und bei den blunt ends?


Trotz der Überhänge wird dann ja nicht automatisch auch eine kovalente Bindung zwischen der Phosphatgruppe des 5'-Endes mit der OH-Gruppe des 3'-C-Atoms hergestellt.
Dazu braucht man in jedem Fall noch ein Enzym, das diese Bindung herstellt: Eine Ligase.

Zu beachten ist dabei (und ich denke, das geht in die Richtung deiner Frage), dass eine Ligation über klebrige Enden effizienter ist als eine über glatte Enden. Diesem Umstande versucht man praktisch dadurch gerecht zu werden, dass man zu einer Ligation von glatten Enden mehr von dem Insert in den Reaktionsansatz gibt als bei einer Ligation von klebrigen Enden.
Auch die Religationsrate des Vektors, also dass die beiden Vektorenden sich wieder miteinander verbinden ist bei ungerichteten Klonierungen (egal ob glatt oder klebrig; obwohl die Religationsrate bei klebrigen Enden in einer ungerichteten Klonierung am häufigsten zu beobachten ist) häufiger. Dem begegnet man, indem man die 5'-Enden des Vektors dephosphoryliert.

Also: Die Ligation mit klebrigen Enden ist stets zu bevorzugen (geht aber manchmal eben nicht), am besten mit unterschiedlicher Sequenz.

Hättest du eine Idee, wie man dann nach einer ungerichteten Klonierung überprüft, in welcher Richtung die Insertion ligiert wurde?
Oder wie man überhaupt überprüft, ob die Insertion erfolgreich ligiert wurde oder ob die Vektorenden miteinander verbunden sind?

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anne100
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BeitragVerfasst am: 13. Nov 2011 18:16    Titel: Antworten mit Zitat

also ich zussammenfassend sagen, dass bei einer gerichtetn klonierung immer zwei unterschiedliche RE sowohl insert als auch vektor schneidet. bei der ungerichteten klonierung schneiden entweder zwei gleiche RE oder aber ein RE, das keine überhänge erzeugt?

und um zu überprüfen ober die insertion auch wirklich eingebaut wurde, würde ich den rekombinanten vektor (also mit insert) in e.coli transformieren. der vektro könnte das z.B. auch noch ein Antibiotikaresistenzgen enthalten wie ampicillin, sodass die bakterien auf ampicillenhaltigem medium ausplattiert werden. und es wachsen dann letztlich nur diejenigen die den vektor aufgenommen haben. naja aber eigentlich weist das nicht wirklich nach ob ligation geklappt hat sondern ob der vektor aufgenommen wurde oder? hmm...dann hab ich keine idee auch zu der richtung der insertion nicht...was müsste man denn da machen?

und dann hab ich noch eine frage zu einer aufgabe die ich machen muss. ichhabe einen bait-vektor pLEXA-N. dieser enthält den ADH1-promotor. davon soll ich jetzt die funktion erläutern. also ich weiß dass der promotir für die initiation der transkription wichtig ist aber was bedeutet das ADH1?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 13. Nov 2011 19:19    Titel: Antworten mit Zitat

anne100 hat Folgendes geschrieben:
also ich zussammenfassend sagen, dass bei einer gerichtetn klonierung immer zwei unterschiedliche RE sowohl insert als auch vektor schneidet. bei der ungerichteten klonierung schneiden entweder zwei gleiche RE oder aber ein RE, das keine überhänge erzeugt?


Thumbs up!
Obwohl es auch zwei unterschiedliche Enzyme sein können, die beide keine Überhänge erzeugen.
Auch können klebrige Enden geglättet werden, indem die Überhänge entweder aufgefüllt oder abgebaut werden, aber das nur am Rande (ist vermutlich jetzt erst mal nicht so wichtig, das spielt dann mehr in der Praxis eine Rolle).
Zudem müssen bei einer glatten Ligation auch Insert und vektor nicht mit den gleichen Enzymen geschnitten werden.


anne100 hat Folgendes geschrieben:
naja aber eigentlich weist das nicht wirklich nach ob ligation geklappt hat sondern ob der vektor aufgenommen wurde oder? hmm...dann hab ich keine idee auch zu der richtung der insertion nicht...was müsste man denn da machen?


Um den Erfolg der Ligation zu überprüfen, präparierst du die Plasmid-DNA aus den Bakterien und verdaust sie mit den Enzymen, mit denen du ligiert hast. Manchmal, vor allem bei glatten Ligationen, zerstörst du allerdings die Restriktionsschnittstelle, dann kannst du mit Enzymen schneiden, die den Vektor zerlegen. Irgendein Fragment muss dann ja das Insert enthalten und dementsprechend grösser sein, als das gleiche Fragment aus dem religierten Vektor. Die Grösse überprüfst du dann gelelektrophoretisch.

Um die Insertionsrichtung zu bestimmen, schneidest du z.B. einmal den Vektor mit einem Restriktionsenzym und dann noch mit einem, das im Insert schneidet (nicht in der Mitte des Inserts, also asymetrisch). So erhältst du abhängig von der Insertionsrichtung verschieden grosse Fragmente.
Nehmen wir beispielhaft einmal an, RE1 schneidet den Vektor in ein 500bp (bp=Basenpaare) grosses und ein 1000bp grosses Stück und RE2 schneidet das Insert in ein 200bp und ein 500bp-Fragment, so erhälst du in der einen Richtung Fragmente von 1000bp und 1200bp (dann hängt das 200bp-Fragment des Inserts an dem 1000bp-Fragment des Vektors) und andersherum Fragmente von 1500bp und 700bp (Dann hängt das 200bp-Fragment des Inserts an dem 500bp-Fragment des Vektors). Das wäre eine Möglichkeit, der Phantasie sind da aber keine Grenzen gesetzt, du suchst also REs, die abhängig von der Insertionsrichtung zwei oder mehr verschieden grosse Fragmente erzeugen.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
und dann hab ich noch eine frage zu einer aufgabe die ich machen muss. ichhabe einen bait-vektor pLEXA-N. dieser enthält den ADH1-promotor. davon soll ich jetzt die funktion erläutern. also ich weiß dass der promotir für die initiation der transkription wichtig ist aber was bedeutet das ADH1?


"ADH" bedeutet Alkoholdehydrogenase, die "1" steht für die Isoform (ich weiss gerade nicht, wieviele Isoformen es in der Hefe gibt, im Menschen sind es mindestens 3).
Was machst du denn damit? Wollt ihr Proteininteraktionen in einem 2-Hybridverfahren untersuchen?
Oder DNA-Protein-Interaktionen in einem 1-Hybridverfahren untersuchen?
Oder warum ausgerechnet ein bait-Vektor?

Zu einem Hefe-ADH1-Promoter wäre hier einmal ein link:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC359619/pdf/molcellb00136-0301.pdf

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BeitragVerfasst am: 13. Nov 2011 19:31    Titel: Antworten mit Zitat

wir haben die sequenz eines zwei-hybrid-vektor (pLEXA-N) gegeben. dieser besitzt verschiedene regionen, wie eben den ADH1-promotor oder auch die Lex-DNA-Bindedomäne. also mit dem artikel kann ich leidern icht so viel anfangen weil mein englisch nicht so gut ist.unglücklich
was hat denn ADH damit zu tun? und es ist doch richt dass die lexa-dna-bindedomäne ein gen ist auf dem vektor das für die dna-domäne kodiert an dem dann das fusionprotein aus lexa-bindedomäne und protein bindet. richtig?
und dann noch was:
ich soll die größe des PCR-Produktes nach der PCR ermitteln. dazu hab ich die größe vom vektor und von der zu kodierenden sequenz gegeben. diese beiden werte muss ich doch dann addieren und mit 35 multiplizeiren weil ja der in einer pcr etwa 35 zyklen ablaufen. oder ist das falsch?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
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BeitragVerfasst am: 13. Nov 2011 19:47    Titel: Antworten mit Zitat

anne100 hat Folgendes geschrieben:

was hat denn ADH damit zu tun?


Das Protein selber gar nichts, der Promoter ist nur ziemlich stark, das heisst, es ist über ihn eine effiziente Expression zu erwarten.
Das ist ja auch nicht das Gen für die ADH, sondern nur der Promoter.


anne100 hat Folgendes geschrieben:
und es ist doch richt dass die lexa-dna-bindedomäne ein gen ist auf dem vektor das für die dna-domäne kodiert an dem dann das fusionprotein aus lexa-bindedomäne und protein bindet. richtig?


Soviel ich weiss, ist das Produkt des lexA-Gens (also das Protein, für das lexA kodiert) ein DNA-Bindungsprotein. Ich glaube, es ist ein Repressor, also ein Protein, das die Transkription verschiedener Gene inhibiert und meine, mich zu erinnern, dass es irgendwas mit DNA-Reparatur zu tun hatte. Wird das nicht exprimiert, wenn die DNA beschädigt ist?

Um aber konkret auf deine Frage einzugehen: das lexA-Gen kodiert für ein Protein, das eine DNA-Bindungsdomäne enthält, wäre die richtigere Formulierung.
Aber ansonsten richtig: Das Fusionsprotein bindet dann an der DNA.


anne100 hat Folgendes geschrieben:
ich soll die größe des PCR-Produktes nach der PCR ermitteln. dazu hab ich die größe vom vektor und von der zu kodierenden sequenz gegeben. diese beiden werte muss ich doch dann addieren und mit 35 multiplizeiren weil ja der in einer pcr etwa 35 zyklen ablaufen. oder ist das falsch?


Um die Größe zu ermitteln, musst du nur den Abstand der Primer voneinander wissen, die Anzahl der Zyklen macht das Produkt nicht grösser, es macht nur mehr Produkte.
Welche Sequenz willst du denn mit der PCR vervielfältigen?
Die Länge dieses Fragmentes legst du zugrunde.

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anne100
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BeitragVerfasst am: 13. Nov 2011 20:14    Titel: Antworten mit Zitat

also ich weiß nur dass die sequenz aus 600 bp besteht und gerichtet kloniert werden soll. ich soll dann noch einen forward und reverse-primer entwickeln für die gerichtet klonierung. (anschließen dann PCR).
meine sequenz lautet(mit überhang):
aattccgaatc...................gtttcaccgc

da muss ich doch jetzt einfach nur die komplementären basen nehmen um einen entsprechenen primer zu bekommen und der muss dann so etwa 25 bp lang sein oder?
anne100
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BeitragVerfasst am: 13. Nov 2011 20:53    Titel: Antworten mit Zitat

hab noch vergessen zu erwähnen, dass ich beim forward-primer auf den reading-frame achten soll, der durch die LexA-DNA-BIndedomäne vorgegeben wird. was heißt das?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 14. Nov 2011 09:25    Titel: Antworten mit Zitat

anne100 hat Folgendes geschrieben:

meine sequenz lautet(mit überhang):
aattccgaatc...................gtttcaccgc


Gib hier bitte auch noch die Bezeichnung der Enden an, denn du musst bei dem Primer-Design die Transkriptionsrichtung beachten.
Also nicht einfach die komplementären Basen nehmen.
In welche Richtung liest denn die Polymerase?
In 3'-5'-Richtung der Vorlage brauchst du die revers-komplementäre Sequenz und in 5'-3'-Richtung nimmst du einfach genau die angegebene Sequenz für den Primer (Wenn du nur einen Strang gegeben hast).
Warum?
Zudem brauchst du nicht nur die Überhänge, sondern die gesamte Erkennungsstelle der Restriktionsenzyme (könntest du die in fetter Schrift hervorheben?), denn du musst das Produkt ja noch schneiden!!!
Ich würde zusätzlich auch noch ein paar Basen an das 5'-Ende der Primer hängen, vielleicht ein GC-Dinukleotid.

Willst du das PCR-Produkt denn direkt schneiden und nach elektrophoretischer Auftrennung und Aufreinigung ligieren oder erst in einen Zwischenvektor, z.B. zur Sequenzierung, zwischenklonieren und aus diesem dann ausschneiden?
Welche Restriktionsenzyme möchtest du denn verwenden?

anne100 hat Folgendes geschrieben:
und der muss dann so etwa 25 bp lang sein oder?


Das wäre O.K., doch achte darauf, dass die beiden Primer nicht komplementär zueinander sind.
Zum Design sowie zur Ermittlung der Schmelztemperatur der Primer bietet sich das freie Programm FastPCR (http://en.bio-soft.net/pcr/FastPCR.html) an (kannst du natürlich auch manuell machen).

anne100 hat Folgendes geschrieben:
hab noch vergessen zu erwähnen, dass ich beim forward-primer auf den reading-frame achten soll, der durch die LexA-DNA-BIndedomäne vorgegeben wird. was heißt das?


Was ist denn ein offenes Leseraster (open reading frame)?

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BeitragVerfasst am: 14. Nov 2011 15:26    Titel: Antworten mit Zitat

also das versteh ich irgendwie so gar nicht.
ich fang einfach nochmal von vorne an:
meine aufgabe ist es die entsprechenden forward-und reverse-primer für die gerichtete klonierung meiner sequenz zu erzeugen und dann anschließend ein pcr-programm.

meine sequenz beginnt und endet so:

atggaacctgaattccgaat......................gtttcgatatga

das ist jetzt die sequenz ohne das die RE geschnitten haben. und innerhalb dieser sequenz liegen dann die schnittstellen für die REs. diese habe ich schon gefunden. und wenn ich jetzt die primer entwickle muss ich da von der ausgangssequenz ausgehen oder von der sequenz die schon mit REs geschnitten wurden? bin grad nämlich etwas verwirrt....
und ich hab auch nur diese sequenz gegeben also ohne 3' und 5' ende. die polymerase liest doch in 5'-3'-richtung oder? und was es mit dem reading-frame des forward-primers, der durch lexA-DBD vorgegeben wird, zu tun hat weiß ich leider auch nicht. weil die ist ja eigentlich auf dem vektor kodiert. aber den brauch ich doch bei dieser aufgabe gar nicht oder?
ich hoffe du kannst mir folgen...ich seh nämlich grad gar nicht mehr durch unglücklich
jörg



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BeitragVerfasst am: 14. Nov 2011 19:05    Titel: Antworten mit Zitat

anne100 hat Folgendes geschrieben:

meine sequenz beginnt und endet so:

atggaacctgaattccgaat......................gtttcgatatga

das ist jetzt die sequenz ohne das die RE geschnitten haben. und innerhalb dieser sequenz liegen dann die schnittstellen für die REs. diese habe ich schon gefunden.


Diese Schnittstellen sollst du auch zur Klonierung benutzen?


anne100 hat Folgendes geschrieben:
und wenn ich jetzt die primer entwickle muss ich da von der ausgangssequenz ausgehen oder von der sequenz die schon mit REs geschnitten wurden?


Du musst mit der PCR eine Sequenz amplifizieren, die mit den REs, die du zur Klonierung benutzen möchtest, geschnitten werden kann.
Der Rest ist wurscht, weil du ja vor der Ligation eh noch schneiden musst. Aufgrund eventueller Verschiebungen des Leserasters des lexA-Gens durch die Insertion in den Vektor könnte allerdings zumindest eine PBS keine Spielräume mehr lassen.
Dazu suchst du Primerbinestellen (PBS) , die geeignet sind. Sie sollten einen nicht zu niedrigen GC-Gehalt haben, da die G-C-Paarung stabiler ist als die A-T-Paarung.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
und ich hab auch nur diese sequenz gegeben also ohne 3' und 5' ende.


Dann ist es Konsens, dass die Sequenz in 5'-3'-Richtung angegeben ist, also links wäre dann dein 5'-Ende.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
die polymerase liest doch in 5'-3'-richtung oder?


Falsch, sie liest in 3'-5'-Richtung auf der Vorlage und synthetisiert den neuen Strang in 5'-3'-Richtung.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
und was es mit dem reading-frame des forward-primers, der durch lexA-DBD vorgegeben wird, zu tun hat weiß ich leider auch nicht. weil die ist ja eigentlich auf dem vektor kodiert. aber den brauch ich doch bei dieser aufgabe gar nicht oder?


Na ja, du darfst das Leseraster des lexA-Gens halt durch deine Ligation nicht zerstören, denn sonst kann daraus kein lexA-Protein synthetisiert werden.
Dazu noch einmal: was ist denn ein offenes Leseraster?

Wenn durch den zu ligierenden Bereich die ORF (Offenes Leseraster, open reading frame) zerstört wird, musst du eventuell durch einen Primer ein paar Basen zusätzlich inserieren. Dann wäre auch die PBS zumindest für den einen Primer nicht variabel.

Wie lang ist denn das Fragment zwischen den RE-Schnittstellen (nach dem Schneiden)?
Mit welcher software arbeitest du?
Kannst du die Sequenzen der Schnittstellen mit jeweils so 30nt drumherum mal posten?

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BeitragVerfasst am: 14. Nov 2011 19:33    Titel: Antworten mit Zitat

also das ist jetzt meine gekürzte sequenz (vorne und hinten kommt noch was ran) und die hervorgehobenen sequenzen sind meine schnittstellen für die REs (zwei verschiedene, da gerichtet), die ich zur klonierung nehmen soll:

gagctcgagttgctcctgcaggattttccggttcatacaaaccagatatcctctgcaatctacgag
atcctattgcagtgtcccaacgaccacatcgaaaaccctaagaagaaaccgtacaattgtccacactcag
gagccaagtgtgatgtcacaggagatattcaaaggctactactgcatctaaggaatgatcacaatgttga
aatgagtgatgggcgtagtttcagtcacagatatgttcatcatgatcctaaacatcttcatcatgctacttgg
atgttaacacttctcgattgttgtggtcgaaaattctgcttgtacttcgaagcgtttcacctgaggaaaacacc
aatgtacatggccttcatgcagtttatgggagatgaagaagaggcaatgagcttcagctatagtttgcagg
tcggagggaatggcagaaagctgacatggcaaggcgtgccgaggagcattcgtgacagtcacaagac
ggttcgtgatagtcaagatggcttaatcatcactcgcaaattggctttgttcttctctaccgacaacaacacc
accgacaaggagctgaagttgaaggaattcgtttcaccgcggggtc

ein offenes leseraster ist ein bereich der die genetische information für ein bestimmtes genprodukt enthält oder? also sozusagen von einem startcodon zu einem stopcodon?
das fragment ist 560 pb lang. und ich arbeite mit keiner software...das muss ich so machen. aber wie mach das denn jetzt mit dem reading frame?

edit:
Ich habe die Sequenz unterteilt, damit die Breite der Beiträge in einem vernünftigen Rahmen bleiben.
PaGe
jörg



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BeitragVerfasst am: 14. Nov 2011 20:13    Titel: Antworten mit Zitat

anne100 hat Folgendes geschrieben:

ein offenes leseraster ist ein bereich der die genetische information für ein bestimmtes genprodukt enthält oder? also sozusagen von einem startcodon zu einem stopcodon?


Thumbs up!

anne100 hat Folgendes geschrieben:
das fragment ist 560 pb lang. und ich arbeite mit keiner software...das muss ich so machen. aber wie mach das denn jetzt mit dem reading frame?


Ich komme, wenn ich deine Sequenz mit SBFI und BTGI schneide (das sind doch deine Enzyme, oder?) auf eine Fragmentlänge von 581bp und nicht 560bp grübelnd
Habe ich die richtigen Enzyme?

Aber egal, es ist auf jeden Fall kein Vielfaches von 3, wie es sein muss, damit die lexA-ORF nich verschoben wird. Warum muss es ein Vielfaches von 3 sein?

Da bleibt ein Rest von 2, also müssen wir noch ein Nukleotid einfügen, das machen wir unmittelbar hinter der SBFI-Schnittstelle.
Hast du das bis hierher verstanden?

Dann könne wir nach meinem Abendbrot meinetwegen noch mit dem Design weitermachen. Überlege dir doch schon mal Primer.

p.S.: Kannst du in der Sequenz in deinem letzten Beitrag noch einige Zeilenumbrüche einfügen? ...damit der Faden hier übersichtlich bleibt.

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BeitragVerfasst am: 14. Nov 2011 20:28    Titel: Antworten mit Zitat

also ich hab die enzyme sac1 und sac2. und bei der länge der sequenz hab aich nur die überhänge mitgezählt aber nicht die gesamte schnittstellen.
primer hab ich schon :
forward-primer:
5'-gagctcgagttgctc-3'

reverse-primer:
5'-gacc-3'
(also der wäre eigentlich länger aber ich hab ja nuredie verkürztw sequenz eingestellt deswegen lass ich das jetzt mal so)

ist das denn so richtig? weil beim forward-primer kann ich die ausgangssequenz übernehmen weil ich ja vom komplementären stragn ausgehe. und beim reverse-primer muss ich die revers komplementäre sequenz nehmen. und wie muss ich jetzt noch was anhängen?

(ich würd ja gerne noch zeilenumbrüche einfügen aber ich kann nicht darauf zugreifen. und wieso muss das ein vielfaches von 3 sein?
jörg



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BeitragVerfasst am: 14. Nov 2011 23:33    Titel: Antworten mit Zitat

anne100 hat Folgendes geschrieben:
also ich hab die enzyme sac1 und sac2.


SacI erkennt doch die Sequenz GAG CTC, du hast aber die Sequenz als Schnittstelle CTG CAG markiert.
Ausserdem erhalte ich dann eine Fragmentlänge von 599bp, wenn ich deine angegebene Sequenz mit sacI und sacII schneide.grübelnd



anne100 hat Folgendes geschrieben:
primer hab ich schon :
forward-primer:
5'-gagctcgagttgctc-3'

reverse-primer:
5'-gacc-3'
(also der wäre eigentlich länger aber ich hab ja nuredie verkürztw sequenz eingestellt deswegen lass ich das jetzt mal so)


Auch der forward-Primer ist eher kurz geraten, wenn das die ganze Sequenz sein soll. Nimm mal die Schnittstelle noch mit rein.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
ist das denn so richtig? weil beim forward-primer kann ich die ausgangssequenz übernehmen weil ich ja vom komplementären stragn ausgehe. und beim reverse-primer muss ich die revers komplementäre sequenz nehmen.


Thumbs up!

anne100 hat Folgendes geschrieben:
und wie muss ich jetzt noch was anhängen


Ich habe mir gerade mal die ORF deiner Sequenz angeschaut und die ist vom Startkodon bis zur sacII-Schnittstelle 397bp lang.
Das Stoppkodon entfernst du mit dem Schneiden durch sacII, was ja auch gewünscht ist, schliesslich willst du ja ein Fusionsprotein erzeugen. Da die ORF aber erst 203 Nukleotide von der sacI-Schnittstelle und ist dann 397bp lang.

Nun brauchst du ein Vielfaches von 3, weil ja 3 Nukleotide jeweils ein Kodon bilden. Wenn du bei der ORF deiner Sequenz also eine nicht durch 3 teilbare Zahl hast und da z.B. 1 Nukleotid übrig ist, verschiebt sich das Leseraster der lexA-ORF um 2 Nukleotide. Dann hast du eine völlig andere Aminosäurezusammensetzung und das lexA-Protein ist ein ganz anderes.
Deswegen musst du in den Primer, der die sacII-Schnittstelle hat (wäre also bei dir der reverse-Primer, weil dein forward-Primer weit ab von der ORF liegt) noch zusätzlich Nukleotide einfügen.
Da deine ORF 397bp lang ist, ergibt sich bei teilen durch 3 ein Rest von 1. Also musst du entweder 1 Nukleotid deletieren oder 2 weitere einfügen und zwar neben die sacII-Schnittstelle, so dass du sie nicht mit wegschneidest, also ORF-wärts.

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BeitragVerfasst am: 15. Nov 2011 09:29    Titel: Antworten mit Zitat

oh stimmt da hab ich mich vertran. ich hab jetzt nochmal die sequenz eingestellt wo die richtigen REs markiert sind und das ist jetzt auch die gesamte sequenz die ich klonieren soll:

atggaacctgaattccgaatcaatgaccttcaggtggaatctcgggttcatgagctc
gagttgctcctgcaggattttccggttcatacaaaccagatatcctctgcaatctacgag
atcctattgcagtgtcccaacgaccacatcgaaaaccctaagaagaaaccgtacaattg
tccacactcaggagccaagtgtgatgtcacaggagatattcaaaggctactactgcatc
aaggaatgatcacaatgttgaaatgagtgatgggcgtagtttcagtcacagatatgttcat
catgatcctaaacatcttcatcatgctacttggatgttaacacttctcgattgttgtggtcgaaa
attctgcttgtacttcgaagcgtttcacctgaggaaaacaccaatgtacatggccttcatgcag
tttatgggagatgaagaagaggcaatgagcttcagctatagtttgcagg
tcggagggaatggcagaaagctgacatggcaaggcgtgccgaggagcattc
gtgacagtcacaagacggttcgtgatagtcaagatggcttaatcatcactcgcaaattgg
ctttgttcttctctaccgacaacaacaccaccgacaaggagctgaagttgaaggaattcg
tttcaccgcggggtcggtcgtgtatggagagaacaggaattccctgtttcgatatga

dre forward primer wäre dann:
5'-atggaacctgaattccgaatcaagaccttcagg-3'

der reverse-primer ist dann:
5'-tcatatcgaaacagggaattcctgttctctccata-3'

aber wie finde ich denn jetzt den reading frame? start-und stopcodon sind ja bei der mRNA. wonach muss ich denn jetzt suchen?
und du wenn du sagst dass beim teilen von 397 durch 3 ein rest von 1 bleibt hast du aufgerundet oder? weil ganz 1 kommt ja nicht raus...

und ich hab ja zuerst eine falsche stelle in der sequenz für ein RE markiert. das wäre auch eine schnittstelle aber eben für ein anderes Enzym. woher weiß ich eigentlich welches von beiden ich nehmen soll? ich hab mich jetzt für sac1 entschieden, weil dadurch die zu klonierende sequenz länger ist. ist das richtig?
jörg



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BeitragVerfasst am: 15. Nov 2011 11:25    Titel: Antworten mit Zitat

Also ich habe deine Sequenz noch einmal gründlich durchgecheckt.
Ein kleines Problem ist, dass die sequenz in deinem letzten Beitrag sich von der zuvor geposteten unterscheidet.
Die letzte ist aber komplett die richtige????

anne100 hat Folgendes geschrieben:

dre forward primer wäre dann:
5'-atggaacctgaattccgaatcaagaccttcagg-3'


Dann fehlt da ein T:

5'-atg gaa cct gaa ttc cga atc aat gac ctt cag g-3'

Ansonsten korrekt, den kannst du nehmen, obwohl mir der GC-Gehalt zu gering wäre....
Und jetzt darf er (muss aber nicht unbedingt) auch etwas kleiner sein...


anne100 hat Folgendes geschrieben:
der reverse-primer ist dann:
5'-tcatatcgaaacagggaattcctgttctctccata-3'


Damit kriegst du Probleme. Er passt, gar keine Frage, doch sollte er, da an diesem Ende das lexA-Gen fusioniert wird, die sacII-Schnittstelle beinhalten, damit du da noch die Nukleotide einfügen kannst, um die lexA-ORF einzuhalten.
Das hast du hier nicht berücksichtigt.



anne100 hat Folgendes geschrieben:
aber wie finde ich denn jetzt den reading frame? start-und stopcodon sind ja bei der mRNA. wonach muss ich denn jetzt suchen?


Nach einem Startkodon. Da du hier den kodierenden Strang angegeben hast (also genau so, wie nachher die mRNA aussieht, nur mit T statt U), suchst du nach einem ATG.
Das Stoppkodon deletierst du ja durch die sacII-Schnittstelle, damit endet deine ORF, wo das Enzym schneidet und danach kommt die lexA-ORF.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
und du wenn du sagst dass beim teilen von 397 durch 3 ein rest von 1 bleibt hast du aufgerundet oder? weil ganz 1 kommt ja nicht raus...


Bei Teilen einer natürlichen Zahl durch eine andere natürliche Zahl hast du immer einen ganzzahligen Rest, da muss man nichts runden.
397:3= 132, Rest 1, weil 132*3=396 und 397-396=1.
Also ein ganzzahliger Rest.
Ich weiss zwar nicht, was du gemacht hast, aber sicher nicht mit Rest dividiert.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
woher weiß ich eigentlich welches von beiden ich nehmen soll? ich hab mich jetzt für sac1 entschieden, weil dadurch die zu klonierende sequenz länger ist. ist das richtig?


Das ist abhängig davon, welche Domäne ihr untersuchen sollt.
Da die von mir angegebene ORF die einzige ist, die ich gefunden habe (also in dem 702bp langen Fragment aus deinem letzten Beitrag beginnend bei Nukleotid Nr.258), ist das Enzym an der 5'-Seite schnuppe, du musst nur 5'-wärts von dem Startkodon bleiben, es sei denn, da sind noch regulatorische Sequenzen, die du untersuchen möchtest. Das Stoppkodon TGA befindet sich ganz am Ende der zuletzt geposteten Sequenz.
Da diese sich von der zuvor geposteten unterscheidet, hast du hier eine ORF von 445bp, nach schneiden mit sacII bleiben noch 397bp. Wenn du mit sacI und sacII schneidest, kommt eine Klonierungssequenz von 598bp heraus. Das einzige Enzym, das ich noch stromabwärts von sacII gefunden habe und das auch geeignet wäre, wäre BsiEI (Erkennungssequenz: CGG TCG), aber auch ich würde mich hier für sacII entscheiden, da der Vektor sich günstig mit sacI und sacII schneiden lässt.

Bei einer zu klonierenden ORF von 397bp bleibt bei Teilen durch 3 wie gesagt ein Rest 1.
Du musst also mindestens den reverse-Primer neu generieren, der muss nämlich die sacII-Schnittstelle enthalten.
Bei dem forward-Primer musst du überlegen, ob du erst ab der sacI-Schnittstelle amplifizieren möchtest, den Rest schneidest du hinterher ja eh ab, ist wie gesagt aber egal.
Wichtig ist, dass das PCR-Produkt beide Schnittstellen enthält.
Auch ist es egal, ob die zu klonierende Sequenz möglichst lang ist, zwei Dinge sind hier wichtig: 1. du brauchst die ORF des zu untersuchenden Proteins ohne das Stoppkodon und 2. du brauchst Schnittstellen, die auch der Vektor hat. Beide Kriterien werden von sacI und sacII erfüllt.

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BeitragVerfasst am: 15. Nov 2011 12:14    Titel: Antworten mit Zitat

...habe mir mal überlegt, welche Primer ich nehmen würde und mir ist da eine GC-reiche Sequenz um die sacI-Schnittstelle aufgefallen.

Vorschlag1: 5'-GGT GGA ATC TCG GGT TCA TGA GCT CG-3'

(sacI-Schnittstelle fett markiert; GC-Gehalt ca. 57,7%, Tm ca 65°C ).


Vorschlag2: 5'-CCA TAC ACG ACC GAC CGC CCG CGG TG-3'

(zusätzlich eingefügte Nukleotide fett und unterstrichen, sacII-Schnittstelle fett markiert, GC-Gehalt ca. 69,2%, Tm ca.70°C)

Ich würde hier dann sogar erstmal versuchen, Primerannealing und Amplifikation bei der gleichen Temperatur laufen zu lassen, also bei der Arbeitstemperatur der Polymerase (72°C).
Man kann aber auch den GC-Gehalt niedriger wählen, dann sinkt die Tm (Schmelztemperatur der Primer).
Wenn das dann nicht klappt, kann man die Tm immer noch senken, damit kann man die Annealing-Spezifität noch erhöhen, also in diesem Fall dann auf so 65°C oder sogar 60°C.
Das musst du dann sehen.

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ann100
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BeitragVerfasst am: 15. Nov 2011 13:36    Titel: Antworten mit Zitat

ja das ist die komplette sequenz. aber ich kann doch nicht einfach ein paar nukleotide anfügen, dann passt das doch nicht mehr zur ausgangssequenz oder? und wieso kann ich noch nukleotide einfügen wenn ich im primer die schnittstelle miteinfüge?
und in der sequenz sind doch mehrere start-und stopcodone enthalten, wie weiß ich denn welche ich nehmen muss um den ORF zu finden? das sind so die sachen die ich noch nicht verstehe...
und wenn es in meiner aufgabe heißt, dass ich die forward-und reverse-primer für die klonierung erzeugen soll, ist damit auch gemeint dass ich auch die netsprechenden primer für den vektor herstellen muss?
ich kapier auch immer ncoh nicht was die LexA-DBD mit dem reading-frame des forward-primers zu tun...och man irgendwie will das alles nicht so in mein kopf...hoffe du hast noch etwas geduld schämen
jörg



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BeitragVerfasst am: 15. Nov 2011 14:08    Titel: Antworten mit Zitat

ann100 hat Folgendes geschrieben:
aber ich kann doch nicht einfach ein paar nukleotide anfügen, dann passt das doch nicht mehr zur ausgangssequenz oder?


Ich war mit meinem Primerdesign etwas voreilig, so passt das nicht so gut, besser wäre es, wenn sich die eingefügten Nukleotide an einem Ende des Primers befinden, habe da nicht richtig nachgedacht.
Aber klar kannst du mit Primern Nukleotide einfügen, warum denn nicht?
Hast du Angst, dass der Primer dann nicht mehr bindet?
Keine Bange...

ann100 hat Folgendes geschrieben:
und wieso kann ich noch nukleotide einfügen wenn ich im primer die schnittstelle miteinfüge?


Weil die Nukleotide "vor" der sacII-Schnittstelle liegen müssen, denn dahinter bringen sie dir nichts mehr, weil du sie ja dann nach der PCR wegschnittest.

ann100 hat Folgendes geschrieben:
und in der sequenz sind doch mehrere start-und stopcodone enthalten, wie weiß ich denn welche ich nehmen muss um den ORF zu finden? das sind so die sachen die ich noch nicht verstehe...


Es muss ein vielfaches von 3 dazwischenliegen, sonst ist es keine ORF.
Ich habe das mit meiner software geprüft und es gibt hier nur die eine ORF.

ann100 hat Folgendes geschrieben:
und wenn es in meiner aufgabe heißt, dass ich die forward-und reverse-primer für die klonierung erzeugen soll, ist damit auch gemeint dass ich auch die netsprechenden primer für den vektor herstellen muss?


Nee, aber du brauchst die Schnittstellen, mit denen du arbeitest ja auch im Vektor. Denn du musst den vektor zumindest schneiden, damit du deine Insertion gerichtet einfügen kannst.

ann100 hat Folgendes geschrieben:
ich kapier auch immer ncoh nicht was die LexA-DBD mit dem reading-frame des forward-primers zu tun.


Der Primer selbst hat ja keine ORF, jedoch das Produkt, das du mit der PCR erzeugst.
Wenn das jetzt kein Vielfaches von 3 ist, sondern ein Nukleotid am Ende übrig bleibt, dann werden für dieses Kodon noch die ersten zwei Nukleotide der lexA-ORF mitgenommen. Die beiden Nukleotide bilden aber eigentlich mit dem Darauffolgenden ein Kodon und nicht mit dem, das bei dir "übrig" ist.
Also darf bei dir hinten keines übrig sein, du brauchst eine ganze Anzahl an Kodons.

Beispiel:

normale ORF: 5'- AGG GGA CAT GGT CCG.....-3'

Nun ligiern wir daran die Sequenz:

5'-....AAG TTC GGT T-3' (hier ist nun ein Nukleotid "übrig", nämlich das T an der 3'-Seite.

Wir fusionieren und erhalten die ORF:
5'-..... AAG TTC GGT TAG GGG ACA TGG TCC G.....-3'

Wie du siehst, haben sich die Kodon-Tripletts verändert und zwar genau ab dem "überschüssigen" Nukleotid. Das Resultat wäre eine andere Basenfolge und damit ein anderes Protein.
Nun fügen wir in die zweite Sequenz noch zwei Nukleotide ein:

5'-....AAG TTC GGT TGG-3'

Wir fusionieren wieder:
5'.... AAG TTC GGT TGG AGG GGA CAT GGT CCG....-3'

Nun sind die Kodon-Tripletts die gleichen und du bekommst die gleiche Aminosäuresequenz.

Neuer Vorschlag Primer2:

5'-CTC CAT ACA CGA CCG ACC CCG CGG CG-3'

Nun hast du 24 Basen, die in Folge komplementär zum Mutterstrang sind und zwei zusätzliche Nukleotide (fett, unterstrichen), die genau an die sacII-Bindestelle (fett) anschliessen. Ich überlege mir aber noch einmal, ob das wirklich die beste Variante ist. Eigentlich wäre es besser, am 5'-Ende die Insertionen einzufügen, hmmm grübelnd
Man könnte jetzt noch die Tm prüfen, aber du hast zumindest für diesen Primer wenig Alternativen, da du ja die Insertionen brauchst.
Hast du jetzt verstanden, warum?

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anne100
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BeitragVerfasst am: 15. Nov 2011 16:31    Titel: Antworten mit Zitat

ok also das mit der bindedomäne hab ich jetzt verstanden:)
und ist es denn auch richtig dass meine primer ganz am anfang bzw. am ende der sequenz ansetzen? achso und die anzahl der nukleotide des primers die ich anhänge muss dann ein vielfaches von 3 sein damit sich das leseraster nicht veschiebt ja? und die nukleotide die ich einfüge müssen ja dann komplementär zur ausgangssequenz sein. und die primer müssen die schnittstellen der RE enthalten ja? dann reicht es doch auch wenn ich die primer so herstelle, dass siejeweils am anfang der erkennungssequenz binden oder?
und für den vektor muss ich also keine extra primer herstellen hab ich das so jetzt richtig verstanden?
achso aber wenn der G/C-gehalt zu gering ist dann kann ich durch nicht einfach noch G und C einfügen weil die basen doch dann eventuell nicht komplementär zur ausgangssequenz sond oder?
und wenn du mir jetzt noch andere varianten für primer angibst, heißt dass meine anfänglichen primer eher ungeeignet sind?
anne100
Gast





BeitragVerfasst am: 15. Nov 2011 16:32    Titel: Antworten mit Zitat

aber das mit dem rausfinden des ORF hab ich immer noch nicht verstanden...ich kann mir dsa irgendwie nicht richtig vorstellen...unglücklich
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
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BeitragVerfasst am: 15. Nov 2011 16:57    Titel: Antworten mit Zitat

anne100 hat Folgendes geschrieben:

und ist es denn auch richtig dass meine primer ganz am anfang bzw. am ende der sequenz ansetzen?


Nee, am "Anfang" ist es relativ schnuppe, aber am Ende nicht, denn da musst du ja noch ein paar Nukleotide "vor" die sacII-Schnittstelle einfügen!!!


anne100 hat Folgendes geschrieben:
achso und die anzahl der nukleotide des primers die ich anhänge muss dann ein vielfaches von 3 sein damit sich das leseraster nicht veschiebt ja?


Nee, die ORF, die du einfügst muss geschlossen sein, das heisst, die gesamte ORF muss ein Vielfaches von 3 als Nukleotidzahl haben.
Wie lang die Primer sind, ist völlig wurscht.


anne100 hat Folgendes geschrieben:
und die nukleotide die ich einfüge müssen ja dann komplementär zur ausgangssequenz sein.


Nee, auch das nicht, du brauchst einfach zwei Nukleotide, weil deine eingefügte ORF oder besser gesagt der Teil der ORF, den du mit lexA fusionieren möchtest bezüglich der Nukleotidanzahl kein Vielfaches von 3 ist.
Also sollen sie gerade nicht komplementär sein, sondern zusätzlich.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
und die primer müssen die schnittstellen der RE enthalten ja?


Nee, nicht zwingend. Ein Primer muss die sacII-Schnittstelle enthalten, da du hier ja noch zwei Nukleotide einfügen musst.
Also geht es nicht anders.
Das PCR-Produkt muss die Schnittstellen enthalten.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
dann reicht es doch auch wenn ich die primer so herstelle, dass siejeweils am anfang der erkennungssequenz binden oder?


Theoretisch ja, aber ein paar Basen daneben würde ich mitnehmen, vor allem, wenn du das PCR-Produkt direkt schneiden möchtest, also ohne es Zwischenzuklonieren (z.B. in einen TA-Vektor oder so).

anne100 hat Folgendes geschrieben:
und für den vektor muss ich also keine extra primer herstellen hab ich das so jetzt richtig verstanden?


Da weiss ich sowieso nicht, wie du darauf kamst, dass du das müsstest.
Aber nein, musst du nicht.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
achso aber wenn der G/C-gehalt zu gering ist dann kann ich durch nicht einfach noch G und C einfügen weil die basen doch dann eventuell nicht komplementär zur ausgangssequenz sond oder?


Nein, kannst du nicht. Bei dem GC-Gehalt geht es um die Stabilität der Primerbindung an der Vorlage, weil eine C-G-Bindung 3 Wasserstoffbrücken ausbildet, eine T-A-Bindung aber nur zwei.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
und wenn du mir jetzt noch andere varianten für primer angibst, heißt dass meine anfänglichen primer eher ungeeignet sind?


Der Primer, den du Reverse-Primer genannt hast ist nicht geeignet, weil er die Nukleotide nicht einfügt, die du vor der sacII-Schnittstelle noch einfügen musst. Diese zwei Nukleotide sollen gerade nicht komplementär zur Ausgangssequenz sein, sie sollen nachher zusätzlich da sein, damit das Leseraster des lexA-Gens eingehalten wird.
Sie müssen am Ende deiner Sequenz sein, damit du dein eigenes Leseraster nicht verschiebst. Allerdings darfst du auch die sacII-Schnittstelle nicht zerstören. Somit müssen sie unmittelbar vor die sacII-Schnittstelle.
Das Einfügen kannst du nur über die Primer machen, obwol ich ehrlich sagen muss, dass mir auch meine bisherigen Vorschläge nicht wirklich gut gefallen, aber wie gesagt, für den einen Primer hast du nicht allzuviele Alternativen: Entweder du deletierst ein Nukleotid oder du inserierst zwei unmittelbar an der sacII-Schnittstelle.
Jetzt gerade gefällt mir die Deletion besser, vorhin war es die Insertion, musst du selbst auch mal überlegen.
Doch dazu musst du erst einmal verstehen, warum du das brauchst.
Also vergiss erst mal meine Primer-Vorschläge und versuche nachzuvollziehen, warum du zwei Nukleotide mehr oder eben eines weniger brauchst:
Weil eben der Rest deiner ORF aus 132 Kodons (=396bp) und einer Base besteht (also insgesamt 397bp). Die eine Base verschiebt das Leseraster der lexA-ORF um zwei Basen nach "links" (siehe Beispiel oben).

anne100 hat Folgendes geschrieben:
aber das mit dem rausfinden des ORF hab ich immer noch nicht verstanden...ich kann mir dsa irgendwie nicht richtig vorstellen..


Eine ORF hat zwischen Start- und Stoppkodon eine ganze Anzahl an Kodons, also muss die Sequenz zwischen Start und Stopp eine Nukleotidanzahl haben, die ien vielfaches von 3 ist, weil ja ein Kodon aus 3 Basen besteht.
Beispiel:

5'-ATG AAG [....] TCG GTA GCG-3'

Hier hast du ein startkodon ATG zu Beginn der Sequenz und ein Stoppkodon TAG, das jedoch nicht als solches erkannt wird, weil es nicht "in frame" ist. Das TA gehört zu dem Kodon GTA und das G zu dem Kodon GCG.
Das ist also keine ORF, obwohl da ein Start-Triplett und ein Stopp-Triplett sind.
Eine ORF wäre es, wenn es so aussähe:

5'-ATG AAG TCG GTA GCG TAG-3'

Zwischen start und Stopp liegt nun ein Vielfaches von 3, du kannst die Sequenz in Tripletts aufteilen und das Stoppkodon ist dann als solches vorhanden.
So suchst du ORFs.
Es ist aber ehrlich gesagt, etwas viel verlangt, die ORF aus deiner Sequenz manuell herauszusuchen, deswegen habe ich zu beginn gefragt, mit welchen Programmen du arbeitest.
Vielleicht möchte euer Dozent auch auf etwas anderes hinaus und ich verkompliziere die Sache hier unnötig, ich kann mir aber nicht vorstellen, worauf er dann hinaus möchte, zumal die Berücksichtigung der lexA-ORF genauso erfolgen muss.
Schliesslich ist so ein Zeug ja mein täglich Brot.....

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RNA?- just another nucleic acid?
anne100
Gast





BeitragVerfasst am: 15. Nov 2011 17:24    Titel: Antworten mit Zitat

in dem ORF den du angegeben hast (445bp) ist doch aber gar nicht die sac1 schnittstelle enthalten oder musst das gar nicht sein. warum?
warum kann ich denn nicht am forward-primer noch nukleotide einfügen, warum muss es gerade der reverse-primer sein? und es wird ja auch darafu hingewiesen dass ich beim forward-primer auf den reading-frame achten soll. ich dachte dass hätte dann damit noch etwas zu tun?
und wenn ich jetzt an meinen reverse-primer (am 3'-ende) einfach noch ein cg anhänge, wäre der primer dann richtig?
jörg



Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg

BeitragVerfasst am: 15. Nov 2011 17:38    Titel: Antworten mit Zitat

anne100 hat Folgendes geschrieben:
in dem ORF den du angegeben hast (445bp) ist doch aber gar nicht die sac1 schnittstelle enthalten oder musst das gar nicht sein. warum?


Die Schnittstelle ist nicht mit ethalten, weil die ORF erst viel später beginnt, also das Startkodon erst "dahinter" kommt.
Da wird noch eine regulatorische Sequenz davor sein.
Das sollte dich aber nicht davon abhalten, sacI zu nehmen, ich täte es auch.
Und die sacII-Schnittstelle liegt in der ORF.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
warum kann ich denn nicht am forward-primer noch nukleotide einfügen, warum muss es gerade der reverse-primer sein?


Weil die da nichts bringen, du nimmst keinen Einfluss auf die ORF und selbst wenn, so würdest du nur dein eigenes Leseraster verschieben, was auch kontraproduktiv wäre.

anne100 hat Folgendes geschrieben:
und es wird ja auch darafu hingewiesen dass ich beim forward-primer auf den reading-frame achten soll. ich dachte dass hätte dann damit noch etwas zu tun?


Die Bezeichnung "forward"- und "reverse"-Primer ist willkürlich, womit der Hinweis eigentlich nicht zu gebrauchen ist.
Woher weisst du, dass der Primer, den du "forward" genannt hast der gleiche ist, der in dem Hinweis gemeint ist?

anne100 hat Folgendes geschrieben:
und wenn ich jetzt an meinen reverse-primer (am 3'-ende) einfach noch ein cg anhänge, wäre der primer dann richtig?


Die Insertion muss an der sacII-Schnittstelle sein. Wenn du die einfach an deinen Primer tust, hast du da nichts von, weil du die dann hinterher eh wieder mit abschneidest. Dein Primer bindet "hinter" der sacII-Schnittstelle.
Wie gesaagt, deinen "forward"-Primer kannst du benutzen, aber der reverse-Primer sollte die sacII-Schnittstelle enthalten und mit zwei zusätzlichen Nukleotiden dann 3' enden.

Sag doch bitte auch noch einmal, ob du das PCR-Fragment direkt schneiden möchtest oder ob du es zwischenklonierst.

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