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anne100
Gast
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 Verfasst am: 15. Nov 2011 18:00 Titel: |
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ich weiß nicht on ich es zwischenlonieren soll oder nicht. darüber wird nichts gesagt...soll das heißen dass ich die beiden zusätzlichen nukleotide direkt in die ausgangssequenz einfügen soll? wie soll das gehen. oh man irgendwie seh ich grad gar nicht mehr durch. gibt es da nicht auch irgenwie was zum veranschaulichen? ich kann mir das einfach nicht vorstellen... |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 18:10 Titel: |
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| anne100 hat Folgendes geschrieben: | | soll das heißen dass ich die beiden zusätzlichen nukleotide direkt in die ausgangssequenz einfügen soll? |
In der Sequenz, die du nachher klonierst, sollen sie schon enthalten sein.
Füge sie doch einmal in die Ausgangssequenz ein, dann hast du die Sequenz, die du klonieren musst (wenn du sie noch mit sacI und sacII schneidest).
Nimm am besten ein CC- oder AA-Dinukleotid. Oder streiche einfach das A "vor" der sacII-Schnittstelle.
Im ersten Fall muss der Primer auf die eingefügten Dinukleotide 3' enden und im anderen Falle sollte die Deletion in der Mitte des Primers sein.
Die sacII-Schnittstelle muss aber auf jeden Fall mit rein, denn die brauchst du.
Günstig ist auch immer, wenn die Primer auf C oder G oder am besten CG oder GC an beiden Seiten enden. Lässt sich nicht immer realisieren, ich denke aber, hier ist das möglich.
Welche Ansätze haben denn deine Kommillitonen??
Ist das eine theoretische Aufgabe oder sollst du das praktisch klonieren?
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RNA?- just another nucleic acid? |
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anne100
Gast
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 18:32 Titel: |
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das ist nur eine theoretische aufgabe und die anderen haben auch keine idee wie das gehen soll.
ich kann doch aber nicht einfach was in die ausgangssewquenz einfügen? ich versteh es einfach nicht.
und ich hab nochmal ne frage zu dem ADH1-promotor. du meintest ja dass es ein starker promotor ist. ADH setzt alkohol zu aldehyde um. wenn man jetzt dieses ADH-promotor nutzt zeigt sich die funktion der ADH dann auch irgendwie? oder heißt der promotor einfach nur so weil er normalerweise bei der ADH-expression zum einsatz kommt? |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 19:00 Titel: |
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| anne100 hat Folgendes geschrieben: |
ich kann doch aber nicht einfach was in die ausgangssewquenz einfügen? ich versteh es einfach nicht. |
Ja auch nur, um dir das mit der ORF zu verdeutlichen und die Primer zu generieren.
Letztendlich klonierst du die Sequenz mit den eingefügten oder weggenommenen Nukleotiden ja auch, in der Sequenz, die du klonierst, sind die also enthalten.
Das war nur die einzige Idee, die ich zu deiner Frage der Verbildlichung hatte.
Ansonsten habe ich hier doch auch schon einige Beispiele geliefert.
Woher kommt denn die Sequenz, dann würde ich auch noch mal in einer genomdatenbank nachschauen, aber zum Menschen habe ich keine Sequenz gefunden, die Ähnlichkeiten mit der deinen hat.
Wie gesagt, es gibt in der Sequenz nur eine geschlossene ORF mit > 100 Aminosäuren. Kleinere finden sich natürlich haufenweise....
Wenn man wüsste, welchem Gen die entstammt, könnte man natürlich schauen, ob meine Annahmen bis hierher richtig sind.
| anne100 hat Folgendes geschrieben: | | wenn man jetzt dieses ADH-promotor nutzt zeigt sich die funktion der ADH dann auch irgendwie? oder heißt der promotor einfach nur so weil er normalerweise bei der ADH-expression zum einsatz kommt? |
Der heisst nur so, weil er das ADH-Gen "antreibt", also ADH-spezifische Wirkungen sind von deinem Protein, das da hinterher heraus kommt, nicht zu erwarten, da es keine Bestandteile der ADH-ORF hat.
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anne100
Gast
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 19:10 Titel: |
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ich hab mir grad nochmal dein beispiel zur verschiebung des leserasters angeguckt. und da ist mir aufgegfallen dass du an die sequenz die "normale ORF" angefügt hast. aber bei mir ist es so, dass erst der promotor kommt, dann die sequenz der lexA-DBD und dann die multiple cloning site mit den verschiedenen restriktionsschittstellen usw. und die RE schneiden ja dann in des MCS und dort wird die sequenz dann eingefügt. nach dem schneiden der RE befinden sich direkt an der DBD noch 11 Nukleotide der MCS und da fügte ich ja nun meine Sequenz an. aber da verschiebt sich doch dann gar nicht hisichtlich der sequenz der DBD. verstehst du was ich meine? da verchiebt sich dann nur das leseraster meiner sequenz und das der MCS (kann man das so sagen, weil da sind ja nur schittstellen für RE drin). |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 19:31 Titel: |
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| anne100 hat Folgendes geschrieben: | | bei mir ist es so, dass erst der promotor kommt, dann die sequenz der lexA-DBD und dann die multiple cloning site mit den verschiedenen restriktionsschittstellen |
Oh ja, gut, dass du das anmerkst.
Ich hatte den Vektor nicht mehr genau im Kopf, habe ihn mir auch gerade noch einmal angeschaut.
SCH*****
Ich hätte ihn mir anschauen sollen, sorry, ich war fest davon überzeugt, dass die lexA-ORF "hinter" dem Fusionsgen liegt.
Beim pLexA-C ist das so, wie ich dachte....
Hab ich wohl verwechselt....
Dann musst du natürlich nur darauf achten, dass sich dein Leseraster nicht verschiebt.
Das ist auch um einiges einfacher, als das, was wir hier die ganze Zeit versucht haben.
Also noch mal von vorn:
Dass sich deine ORF verschiebt, soll natürlich auch nicht passieren.
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anne100
Gast
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 19:48 Titel: |
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und was muss ich jetzt machen damit sich das leseraster meiner sequenz nicht verschiebt? |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 20:00 Titel: |
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Das prüfe ich gerade, ob sich da überhaupt was verschiebt, ich glaube nämlich, das passt, wenn du mit sacI und sacII schneidest.
Aber ich schaue noch, ist nur mein erster Eindruck....
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 20:09 Titel: |
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Da verschiebt sich nichts....
Von dem Ende der lexA-ORF bis zum Ende der sacI-Schnittstelle sind 12 Nukleotide.
Von dem Beginn deiner Sequenz bis zum Beginn der sacI-Schnittstelle sind es 57 Nukleotide, die du durch Schneiden mit sacI deletierst; beide sind durch 3 teilbar.
Wenn du sacI und sacII nimmst, müsste das problemlos klappen.
Nochmal sorry, dass ich die Vektoren verwechselt habe.....
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anne100
Gast
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 20:44 Titel: |
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gatcacatcagccagacaggtatgccgccgacgcgtgcggaaatcgc
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caccgcgg
gtcgac
also ich hab dann jetzt mal die sequenzen so eingestellt wie ich sie zusammenfügen würde. der erste teil ist die lexA-DBD. dann kommt ein teil der MCS. dann kommt meine sequenz, wobei ich diese schon mit RE geschnitten habe (makiert sicnd die schnittstellen) und zum schluss kommt dann nochmal ein teil der MCS usw.
ist es denn so richtig dass ich die sequenz einfach so einfügen kann wenn ich die geschnitten habe?
ich komme aber irgendwie nicht auf die zahlen die du angegeben hast wenn ich das so mache wie oben. oder ist das falsch?
und wie ist das nun mit den primern? wenn sich nichts verschiebt kann ich dann die primer nehmen die ich anfangs erstellt habe? |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 21:10 Titel: |
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| anne100 hat Folgendes geschrieben: |
[...]
gaattc
gagctgagttg [...] |
Da fehlt ein C (die sacI-site wird nach Ligation vollständig wiederhergestellt):
[...lexA...]
gaattc
gagctcgagttg
| anne100 hat Folgendes geschrieben: |
gagctgagttgctcctgcaggattttccggttcatacaaaccagatatc
ctctgcaatctacgagatcctattgcagtgtcccaacgaccacatcgaaaaccc
taagaagaaaccgtacaattgtccacactcaggagccaagtgtgatgtcacag
gagatattcaaaggctactactgcatctaa[...] |
Wo kommt das T auf einmal her (fett, unterstrichen, fast am Ende der zitierten Sequenz)???
Die letzte Sequenz hiess an der Stelle [...]GCATCAA[...]????
| anne100 hat Folgendes geschrieben: | | ist es denn so richtig dass ich die sequenz einfach so einfügen kann wenn ich die geschnitten habe? |
So wie ich das sehe, kannst du das.
| anne100 hat Folgendes geschrieben: | | ich komme aber irgendwie nicht auf die zahlen die du angegeben hast wenn ich das so mache wie oben. oder ist das falsch? |
Wieviele Nukleotide hast du von der Ausgangssequenz deletiert, wenn du die sacI-Schnittstelle mitzählst?
Ich komme da auf 57.
Dann musst du die sacI-Schnittstelle nur komplett zu dem Vektor rechnen. Von der lexA-ORF bis hinter die sacI-Schnittstelle sind es 12 Nukleotide. Du hattest 11, da fehlte aber eines (siehe oben).
| anne100 hat Folgendes geschrieben: | | und wie ist das nun mit den primern? wenn sich nichts verschiebt kann ich dann die primer nehmen die ich anfangs erstellt habe? |
Kannst du, ich würde sie wie gesagt so wählen, dass sie auf ein G oder ein C an beiden Seiten enden, aber das ist auch ein bischen Geschmacks- und Erfahrungssache....
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anne100
Gast
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 21:23 Titel: |
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dann ist es doch auch ok wenn ich meine primer so auf 25 bp kürze oder weil wir haben gelenr dass die in etwa so eine größe haben sollen.
und wenn ich jetzt die größe des pcr-produkt nach der pcr (mit den überhängen die für die erzeugung des rekombinanten vektors benötigt werden) ermitteln soll, nehm ich dann die gesamte ausgangssequenz? weil so hab ich ja auch meine primer gewählt...das müssten ja dann 699 bp sein. oder muss ich die deletierten sequenzen abziehen. dann würde ich nämlich auf 606 bp kommen. |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 21:29 Titel: |
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| anne100 hat Folgendes geschrieben: | dann ist es doch auch ok wenn ich meine primer so auf 25 bp kürze oder weil wir haben gelenr dass die in etwa so eine größe haben sollen.
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Kannst du machen, musst du aber nicht...
Dein PCR-Produkt sind die Primer plus die dazwischenliegende Sequenz.
Das hat aber keine Überhänge.
Die erhältst du erst nach dem Schneiden.
Oder soll garantiert das ganze Fragment kloniert werden?
Dann müsstest du Primer mit Überhängen generieren und kannst die sac-Schnittstellen nicht nehmen???
Wie konkret lautet da die Aufgabe?
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anne100
Gast
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 21:39 Titel: |
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also die aufgabe ist genau so wie ich sie geschrieben hab. also wir sollten ja vorher zwei geeignete schnittstellen aus der zu klonierenden sequenz raussuchen. also denk ich mal dass es davon ausgeht. ist es dann die gesamte sequenz oder doch nur die geschnittene? |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 22:05 Titel: |
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Die zu klonierende Sequenz ist dann nur die geschnittene.
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anne100
Gast
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 22:13 Titel: |
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ok. supi. und dann hätte ich noch eine letzte frage zum ablauf der klonierung. ich soll dazu die plasmidisolation-und amplifikation und restriktionsanalyse erklären. mit plasmidamplifikation ist doch gemeint dass wenn das bakterium das plasmid aufnimmt dass das plasmid unabhängig vom chromosom des bakteriums repliziert wird oder? aber mit den andern beiden kannich irgendwie nicht richtig was anfangen. im netz hab ich noch zur restriktionsanalyse grfunden dass dabei auf schnittstellen für RE geprüft werden. kannst du mir hierbei nochmal helfen?  |
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jörg
Anmeldungsdatum: 12.12.2010
Beiträge: 2107
Wohnort: Bückeburg
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| Verfasst am: 15. Nov 2011 22:29 Titel: |
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| anne100 hat Folgendes geschrieben: | | mit plasmidamplifikation ist doch gemeint dass wenn das bakterium das plasmid aufnimmt dass das plasmid unabhängig vom chromosom des bakteriums repliziert wird oder? |
Würde ich auch sagen.
Bei der Isolation geht es darum, die Plasmid-DNA zu präparieren.
Dazu musst du dir mal das Prinzip der alkalischen Lyse anschauen.
http://de.wikipedia.org/wiki/Plasmidpr%C3%A4paration
Und Restriktionsanalyse heisst einfach, dass du ein Plasmid mit geeigneten Restriktionsenzymen schneidest, um z.B. zu schauen, ob deine Insertion enthalten ist.
Nach dem Schneiden trennst du die Fragmente dann gelelktrophoretisch auf, um die Bandengrössen zu analysieren.
Wir haben das irgendwo am Anfang dieses Fadens schon einmal am Rande thematisiert, als es darum ging, wie man die Ausrichtung eines ungerichtet klonierten Fragmentes erfährt.
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