untersuchung auf insert

pcr-agent · Anmeldungsdatum: 13.03.2008 Beiträge: 4

Hey Leute! Hilfe

Für mein Problem ist ein wenig komplex, so dass ich erst einmal ein wenig dazu erzählen muss!
also,...es wurde ein DNA-Plasmid in einen E.coli-Stamm transferiert. Nun soll bestätigt werden, ob dieses Plasmid auch ein bestimmtes Insert trägt.
Die Basenpaar-Länge dieses Inserts ist bekannt.
nun hat man mehrere Klone ausgewählt und ihre Plasmide in einer PCR amplifiziert.
Die Hälfte dieser amplifizierten Plasmide, wird direkt auf ein Agarosegel gegeben (nennen wir es Gel 1).
Zu der anderen Hälfte wird ein Restriktionsenzym gegeben. Dieses schneidet das Plasmid an einer bestimmten Sequenz, die in dem gewünschten Insert liegt! Nun wird auch dieses zeugs auf ein weiteres Agarosegel gegeben (Gel2).
Meine Frage ist nun, ob ich den Zweck dieses Ganzen auch richtig verstanden habe!?
Es müsste doch so sein, dass im direkten Vergleich von Gel 1 + 2 an den Stellen, an denen DAS Insert liegt, eine Abnahme der Farbdichte zu sehen sein muss!? Und da, wo die größte Abnahme ist, müsste auch am Meißten von dem Insert sein! Richtig?
Was genau ist dann auf dem Gel 2 zu sehen? Bestimmt bleibt einmal eine Bande auf der selben Stelle, an der auch auf Gel 1 eine zu sehen war (denn es könnten ja Plasmide mit der selben Sequenzlänge, aber ohne dem Insert vorhanden sein)...aber müssten nicht auch noch zwei weitere Banden zu sehen sein? Denn das Plasmid wird ja irgendwo in der Mitte geschnitten, so dass noch eine Bande vor und eine nach der Schnittstelle entsteht!
Wäre nett, wenn ihr mir bei der Überlegung zu dieser komplizierten Geschichte unterstützen könntet!
Vielen DAnk;-)

PaGe · Moderator Anmeldungsdatum: 19.03.2007 Beiträge: 3549 Wohnort: Hannover

Gehe bei Ansatz 2 davon aus, dass das gesamte vorliegende Insert (sofern es das richtige ist) geschnitten wird. Damit hast du kein vollständiges Insert mehr und damit zwei kleinere Bande, die zusammen die große Bande ergeben. Das hast du ja schon richtig erkannt.
Dein Annahme, dass in einer Probe 2 unterschiedliche Sequenzen vorhanden sind, ist durch die PCR und die Beschränkung der Größe eines Plasmids beinahe ausgeschlossen. Du vervielfältigst ja nur einen bestimmten Bereich des Plasmids, in dem du die Sequenzen eingeschleust hast.

pcr-agent · Anmeldungsdatum: 13.03.2008 Beiträge: 4

vielen Dank, für die antwort..aber ich hätte da noch ein frage dazu:

wenn die farbintensität der bande abnimmt, so heißt das doch dass die konz. der dna ebenfalls abgenommen hat..oder?
Dürften dann in gel 2 die Banden blasser sein?
Bei mir sind sie es..ABER die Menge der Banden ist doch gleich geblieben..sie sind nur kleiner...also dürfte die farbdichte doch auch NICHT abnehmen!?

PaGe · Moderator Anmeldungsdatum: 19.03.2007 Beiträge: 3549 Wohnort: Hannover

Da nicht ausschließen kannst, dass du unterschiedliche Probemengen auf das Gel aufgetragen hast, würde ich diese Schlussfolgerung nur mit außerordentlicher Vorsicht vornehmen.

Bei den kleinen Banden muss die Farbdichte auch abnehmen, da du dort ja weniger Material hast (die Anzahl der DNA-Stränge hat sich nicht verändert, sie sind aber kürzer geworden. => weniger Basen, mit denen das EtBr reagieren kann).

Bert · Anmeldungsdatum: 26.09.2007 Beiträge: 82 Wohnort: Niedersachsen