Gentechnik

estrella · Anmeldungsdatum: 24.10.2004 Beiträge: 17

Welches Verfahren nutzt man, um die neu kombinierte DNA (bestehend aus spender- und VektorDNA) in die Zellen eines Empfängerorganismus einzuschleusen?

beachboy · Anmeldungsdatum: 26.09.2004 Beiträge: 35

Um Fremd-DNA in Empfängerorganismen zu transformieren sind immer die folgenden grundlegenden Schritte notwendig:

• DNA aus dem Spenderorganismus wird isoliert und mithilfe von Restriktionsenzymen in Fragmente zerlegt.
• Zur Übertragung der Spender-DNA wird in der Regel ein Transportmole-kül benötigt, ein Vektor (Plasmid). Er besteht ebenfalls aus DNA. Die Vektor-DNA wird isoliert und mithilfe des gleichen Enzyms aufgeschnit-ten, sodass sich die Spender-DNA anlagern kann.
• Durch das Enzym DNA-Ligase werden beide DNA-Moleküle verbun-den.Die neu zusammengefügte, so genannte rekombinante DNA wird in die Zellen eines Empfängerorgansimus eingebracht.
• Zellen, die rekombinante DNA aufgenommen haben werden selektiert und vermehrt.

Dann gibt es versch. Methoden, je nach Empfängerorganismus z.B. Plasmide als Vektoren:

Als Plasmid bezeichnet man ein kleines, ringförmiges DNA-Molekül, das in Bak-terien und bei einigen Hefearten vorkommt. Es existiert getrennt vom übrigen Genom, trägt eigene Gene und kann sich unabhängig vermehren. Bakterien könnten im Grunde zwar ohne ein Plasmid leben, doch die meisten der auf den Plasmiden liegenden Gene bringen ihnen Vorteile, z. B. Resistenz gegen Antibio-tika oder Umweltfaktoren. Die Größe solcher Plasmide variiert zwischen 1-500 kb. Kb ist die wissenschaftlich gebräuchliche Abkürzung für die Größenangaben einer DNA: 1kb bedeutet eine Kilobase = 1000 Basen, bzw. in Doppelstrangan-ordnung 1000 Basenpaare (exakt Nucleotidpaaren). Die Fähigkeit, die Zell-membran unter bestimmten Umständen passieren zu können, einen eigenen Replikationsursprung, d.h. unhabhängig repliziert werden zu können, eigene Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme zu besitzen und zudem noch einen gewissen Umfang Fremd-DNA aufnehmen zu können, machen Plasmide zu op-timalen Vektoren. In gentechnischen Verfahren kommen meist künstlich kon-struierte Plasmide zum Einsatz, die –entsprechend den Erfordernissen des je-weiligen Experiments – aus Bestandteilen von verschiedenen anderen Plasmi-den zusammengebaut werden. Solche Plasmide werden nach ihrem Hersteller benannt. Zum Beispiel: pSC101, das Plasmid, welches Stanley Cohen bei sei-nem grundlegenden Experiment verwendete (s. Kapitel 2. Geschichte der Gen-technik). Ein anderes Paradebeispiel und häufig verwendetes Plasmid ist das pBR322. Es trägt zwei Gene mit Antibiotikaresistenz gegen Ampicillin und Tetra-cyclin, zudem ist es Träger von fünf Restriktionsschnittstellen.

oder Bakterien

Um fremde Gene in Pflanzenzellen zu schleusen, wird meist das Plasmid aus dem Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens verwendet. Es verursacht Tumorbildung, daher befinden sich auf dem Plasmid Gene, die den Gentransfer und das Tumorwachstum steuern. Um dies zu verhindern, werden die daran beteiligten Gene entfernt und durch erwünschte ausgetauscht

oder Viren (hier Retroviren)

Ein anderes virales Vektorsystem sind die Retroviren, zu denen auch HIV ge-hört, die bestuntersuchten Vektoren für menschliche Zellen. Da sie nur sich tei-lende Zellen infizieren können, kommen sie vor allem in Genübertragungen in-nerhalb Zellkulturen zum Einsatz. Die Erbsubstanz der Retroviren besteht aus einem Einzelstrang RNA. Zudem besitzen sie ein spezifisches Enzym, die Rever-tase, auch reverse Transkriptase genannt, mit dessen Hilfe die RNA dieser Vi-ren, sobald das Virus sie in eine Zelle geschleust hat, in eine komplementäre DNA umgeschrieben werden kann.

Nach dieser Überschreibung von RNA nach DNA, wird mit Hilfe des ebenfalls viruseigenen Enzyms Integrase die virale DNA in das Genom der Wirtszelle sta-bil integriert. Diese Formation nennt man Provirus. Wie die Adenoviren müssen auch die Retroviren vor ihrem Einsatz in der Gentherapie gentechnisch verän-dert werden, so dass ein retroviraler Vektor entsteht, der Zellen befallen kann, sich aber nicht mehr vermehren kann.

Direkte Genübertragung

Besonders in der Pflanzenzucht kommt es immer wieder zu Problemen mit Vek-toren, deshalb greift man zu physikalische Methoden, die die DNA direkt über-tragen. Alle Verfahren beruhen darauf, dass die DNA durch die Zellmembran und Kernhülle hindurch in den Zellkern gelangt. Ein Verfahren ist die Kalzi-umpräzipitations-Methode, hierbei werden Zellen mit feinkörnigem ausgefälltem Kalziumphosphat, dem DNA zugegeben ist, behandelt. Diese nehmen die DNA durch Endozytose auf. Obwohl diese Methode schon lange explizit in der Bakte-riengenetik angewandt wird, ist der genaue Mechanismus der Aufnahme noch weitgehend unklar. Ein weiteres Verfahren ist die Elektroporation, die wie die Kalziumpräzipitations-Methode schon lange Benutzung findet. Die Zellen werden dabei einem elektrischen Feld ausgesetzt, wobei sich die Poren der Zellmemb-ran leicht öffnen und die Permeabilität erhöht wird. Somit können die Plasmid-vektoren die Zellmembran passieren. Beim Partikelbeschuss auch Genkanone genannt (engl.: gengun bzw. particle bombardement), werden Zellen mit Gold- oder Wolframskügelchen, die mit Fremd-DNA überzogen sind, beschossen. Die Kügelchen durchschlagen die Zellmembran und die DNA kann in die Zelle ge-langen. Die Verletzungen der Zellen, die dabei entstehen, sind minimal und re-generierbar. Bei Tieren wird Fremd-DNA meist mithilfe einer feinen Hohlnadel oder Mikrokapillare in die Zellen injiziert. Diese sog. Mikroinjektion ist das si-cherste Verfahren, DNA in den Zellkern einzubringen. Die Methode erfordert jedoch eine ruhige Hand und ein gutes Auge.

So kleiner Auszug aus meiner Seminararbeit...

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lg
beach