PCR - Fragen (Facharbeit)

MagicAnna · Anmeldungsdatum: 31.08.2007 Beiträge: 4

Hallo!

Ich habe meine Facharbeit über "PCR-Anwendungsmöglichkeiten in der Medizin und Kriminalistik" geschrieben und sie auch schon abgegeben. Nächste Woche werde ich wahrscheinlich meine mündliche Prüfung darüber haben. Ich habe mir jetzt die ganzen Sachen nocheinmal angeschaut, doch eine Frage ist mir bis jetzt ungeklärt geblieben. Ich hab sie hier schon mal gestellt, aber niemand konnte sie mir beantworten.

1.) Gibt man bei der PCR nur eine bestimmte Sorte des Primers hinzu oder unterschiedliche? Ansonsten kann ich mir es nicht erklären, warum die PCR-Produkte bei der Elektrophorese nach Größen aufgetrennt werden, wenn doch nur eine bestimmte Sequenz amplifiziert wird. Ich frage mich nur, woher ich die unterschiedlich lange Fragmente nach der PCR herkommen.

2.) Es werden öfters vier unterschiedliche Farben hinzugegeben, damit man sie bei der Analyse erkennt. Nun frage ich mich, warum ich unterschiedliche Farben hab? Stellt eine Farbe eine bestimme Länge der Basen dar oder die jeweiligen Nukleotiden? Und wozu Farben? Was sagen sie dann aus?

3.) Warum verwendet man beim Genetischen Fingerabdruck Restriktionsenzyme? Die sind doch überflüssig, wenn ich die PCR mache, da ich die gesuchte Sequenz sowieso durch Anlagerung der Primer bekomme.

Ich hoffe, ihr könnt mir da weiterhelfen, auch, wenn ihr nur eine Frage beantworten könnt,ist ziemlich dringend!

Vielen Dank im Voraus! Anna

revilo · Anmeldungsdatum: 13.12.2007 Beiträge: 79

1.) Gibt man bei der PCR nur eine bestimmte Sorte des Primers hinzu oder unterschiedliche?

Man gibt einen Vorwärts-und einen Rückwärtsprimer zu dem Reaktionsgemisch hinzu. Wenn du das gleiche Gen bei unterschiedlichen Menschen durch PCR amplifizierst, sind die resultierenden PCR-Prdukte gleich groß (Unterschiede bezüglich der Nukleotid-Sequenz kannst du ja nicht anhand der Fragmentgröße erkennen).
Wenn du unterschiedlich große Fragmente bekommst kann das mehrere Ursachen haben:
Es gibt Gene, die nicht als Einzelkopie vorliegen, diese Gene können sich in ihrer Länge unterscheiden.
Der Mensch ist diploid, wenn bei einem Chromosom Mutationen stattgefunden haben (Duplikation, Deletion, Translokation oder Inversion) können auch unterschiedlich große Fragmente bei einer PCR entstehen.

2.) Was meinst du mit Farben ?
Die Nukleotide können mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt sein, damit man die Sequenzierreaktion spektroskopisch auswerten kann, dann besitzt jedes Nukleotid eine andere fluoreszierende Gruppe.

3.) Warum verwendet man beim Genetischen Fingerabdruck Restriktionsenzyme? Die sind doch überflüssig, wenn ich die PCR mache, da ich die gesuchte Sequenz sowieso durch Anlagerung der Primer bekomme.

Den ersten Teil hast du beantwortet: Die PCR ist dazu da, um die DNA zu vermehren. Die Restriktionsenzyme sind dazu da, um Unterschiede in der Sequenz festzustellen. Restriktionsenzyme schneiden die DNA an bestimmten Erkennungssequenzen. Die Erkennungssequenz umfasst die Abfolge mehrerer Nukleotide. Wenn du zwei Proben hast, die sich in den Schnittmustern unterscheiden, deutet dies auf Mutationen in den Erkennungssequenzen hin. Du hast dann die DNA von zwei verschiedenen Probanden amplifiziert.

nangillala · Anmeldungsdatum: 20.01.2008 Beiträge: 11

Hi Anna,
interessantes Thema hast du dir ausgesucht. Hier mal meine Vorschläge ohne Garantie auf Richtigkeit:

MagicAnna · Anmeldungsdatum: 31.08.2007 Beiträge: 4

Ich verstehe aber immer noch nicht, woher die unterschiedlichen Längen der Amplifikate nach einer PCR herkommen??? Während einer Elektrophorese werden diese ja nach Größe aufgetrennt, aber wie geht das, wenn die PCR Produkte sowieso alle gleich lang bzw. groß sind??

Okay, nehmen wir jetzt mal an, die Nukleotiden werden jetzt mit der jeweiligen Farben markiert, fluoresziert und so erkennt man sie dann bei der Sequenzierung. Nun frage ich mich aber, wenn ich mir zB die Auswertung eines Vaterschaftstestes ansehe, wie z.B. alle vier Farben an einer Stelle gleichzeitig auftreten können? Ich meine, wenn ich jetzt bei Nukleotid T angelangt bin, das meinetwegen mit der Farbe rot markiert ist, dann sollte auch nur an dieser Stelle ein Peak oder sonstwas angezeigt werden. Doch oftmals werden mehrere auf einmal gezeigt. (Ich schick im Anhang was mit, damit ihr versteht, was ich meine)
Manchmal werden auch nur einfach zwei Farben angegeben. Ich hoffe, ihr versteht mein Problem.

Die anderen Sachen habe ich jetzt verstanden, herzlichen Dank an die Antworter ;-)

LG Anna