Frage zur Sequenzierung der DNA

suiop · Gast

Meine Frage:
Hallo,

ich verstehe diesen Abschnitt eines Textes über die Sequenzierung der DNA nicht.
Seit mit der Taq-Polymerase eine temperaturstabile DNA-polymerase verfügbar ist, kann das Sanger-Coulson-Verfahren wie eine PCR geführt werden und besteht wie diese aus den drei Einzelschritten Schmelzen, Markieren mit einem Primer und Verlängern. Im Vergleich zur PCR besteht aber ein wesentlicher Unterschied: es darf nur einer der beiden primer zugesetzt werden, damit nur einer der beiden Matrizen-Einzelstränge repliziert wird. Die vorgeschaltete PCR wird entweder so geführt, dass die Primer vollständig aufgebraucht werden, oder der zu sequenzierende DNA-Matrizen-Strang muss vor der Weiterverarbeitung aufgereinigt werden.

Also ich verstehe nicht erstens: Weshalb muss nur ein einzelstrang repliziert werden und zweitens verstehe ich nicht die wirkung bzw. die zwei letzten genannten methoden.

Vielen dank im voraus

lg suiop

Meine Ideen:
Also ich habe da wirklich keine Ahnung aber ich vermute dadurch das man exakt arbeiten muss, da man ein fremdes Gen sequenzieren möchte, sollte man nur einen einzelstrang nehmen um nicht am ende w´verwirrt zu sein welche einzelnen stücke zu welchem strang gehen. aber eigentlich sind die stränge ja komplementär also macht dies keinen großen sinn, oder ?

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

suiop · Gast

Hallo

ertsmal danke für die Antwort

und dann die zweite
Die vorgeschaltete PCR wird entweder so geführt, dass die Primer vollständig aufgebraucht werden, oder der zu sequenzierende DNA-Matrizen-Strang muss vor der Weiterverarbeitung aufgereinigt werden.

Diese beiden Methoden habe ich gemeint bzw. diesen Satz verstehe ich nicht.

jörg · Anmeldungsdatum: 12.12.2010 Beiträge: 2107 Wohnort: Bückeburg

Was passierte denn, wenn beide Primer noch in dem Ansatz wären?
Dann hättest du das gleiche Problem, als wenn du beide zugäbest, du sequenzierst aus beiden Richtungen gleichzeitig und kannst damit nicht mehr konkret ein Nukleotid einer Position zuordnen, da du für jede Position zwei Signale hast. Da steht dann auch nicht das koplementäre Nukleotid an der entsprechenden Position.
Ein Beispiel:

5'-ATGCTC-3' ist die sequenzierte Basenfolge.
Aus der anderen Richtung: 5'-GAGCAT-3'.
Nun hast du an Position Nr. 1 sowohl ein Signal für Adenosin als auch für Guanin. Woher weisst du, welches Nukleotid dort "wirklich" steht und wie die Stränge zueinander angeordnet sind?

Deswegen musst du die Primer, die du in der vorgeschalteten PCR verwendest, loswerden. Also entweder den DNA-Strang aufreinigen oder sichergehen, dass die Primer "verbraucht" wurden.

Erkläre doch einmal die Kettenabbruchmethode und wie ein Nukleotid eines sequenzierten Stranges einer Position zugeordnet wird.